馮磊++王偉峰++吳培培++褚軒++陳麗++侯繼波

摘要：分析比較了3種不同微載體懸浮培養(yǎng)工藝——分批換液式、消化傳代放大式、循環(huán)灌注培養(yǎng)式對Marc-145細(xì)胞微載體培養(yǎng)效能及生理代謝的特點(diǎn)及差異，并實(shí)現(xiàn)了從5 L至60 L反應(yīng)器放大過程的PRRSV實(shí)際增殖應(yīng)用。結(jié)果表明，在5 L動物細(xì)胞反應(yīng)器中使用相同的微載體用量6 g/L，分批換液式培養(yǎng)和消化傳代放大式培養(yǎng)僅獲得27×105～28×105 cells/mL的細(xì)胞密度，低于循環(huán)灌注培養(yǎng)式的培養(yǎng)能力（59.4×105 cells/mL）。根據(jù)這3種不同培養(yǎng)工藝的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并實(shí)施了可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的工藝流程，即Marc-145種子細(xì)胞以循環(huán)灌注培養(yǎng)方式在5 L反應(yīng)器中完成初級培養(yǎng)，經(jīng)消化傳代工藝，將種子細(xì)胞放大接種于60 L反應(yīng)器中進(jìn)行分批換液式的二級培養(yǎng)，用于PRRSV的大規(guī)模增殖，結(jié)果顯示PRRSV增殖滴度可達(dá)到108.3TCID50/mL。該過程成功地模擬了Marc-145細(xì)胞在工業(yè)級水平上的放大培養(yǎng)操作工藝，其放大倍數(shù)達(dá)到1 ∶3的傳代系數(shù)，具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；微載體培養(yǎng)；Marc-145細(xì)胞；循環(huán)灌注培養(yǎng)；分批換液式培養(yǎng)；消化傳代式培養(yǎng)

中圖分類號： Q943.1；S858.285.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0247-05

收稿日期：2014-12-26

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號：201303046）。

作者簡介：馮磊（1979—），男，江蘇南通人，博士，副研究員，主要從事獸用生物制品工程技術(shù)研究。E-mail：fenglnt@hotmail.com。

通信作者：侯繼波，研究員。E-mail：houjibo@jaas.ac.cn。豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染?。ㄘi藍(lán)耳?。1]?？刂曝i繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的主要辦法是使用疫苗進(jìn)行免疫防控，而提高病毒增殖規(guī)模及滴度是疫苗生產(chǎn)的一個重要目標(biāo)。目前該疫苗的生產(chǎn)用細(xì)胞株為Marc-145細(xì)胞[2]，具體的生產(chǎn)工藝依然是實(shí)驗(yàn)室滾瓶培養(yǎng)工藝的簡單數(shù)量放大，其生產(chǎn)規(guī)模、產(chǎn)品質(zhì)量都有待于進(jìn)一步提高。在生物反應(yīng)器中完成細(xì)胞株的懸浮培養(yǎng)及病毒增殖，并按照工業(yè)規(guī)模要求完成規(guī)模放大是亟待解決的難題。

自從1976年van Wezel開發(fā)出動物細(xì)胞微載體培養(yǎng)技術(shù)[3]，生物制藥領(lǐng)域進(jìn)入了利用體外動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白、抗體、細(xì)胞因子、疫苗等生物技術(shù)藥物的高速發(fā)展時期[4-5]。到目前為止，微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)已在多種疫苗，如狂犬病疫苗[6]、人流感疫苗[7]、黃熱病毒疫苗[8]等大規(guī)模制備中起到關(guān)鍵性的作用。同時動物細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)也逐步形成了一些獨(dú)特的培養(yǎng)條件、放大工藝及病毒增殖策略，以適用于不同的疫苗制備工藝需求。

本研究以Marc-145細(xì)胞為研究對象，在實(shí)驗(yàn)室5 L動物細(xì)胞反應(yīng)器中考察了分批換液式、消化傳代放大式、循環(huán)灌注式3種不同培養(yǎng)工藝對該細(xì)胞在微載體（cytodex 1）上生長及代謝的影響，按照該疫苗工業(yè)生產(chǎn)要求，評價(jià)并設(shè)計(jì)出不同培養(yǎng)工藝在細(xì)胞培養(yǎng)、病毒增殖過程中的具體應(yīng)用模式，最終在60 L培養(yǎng)體積中實(shí)現(xiàn)整個病毒增殖過程，為我國PRRS疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及種毒

Marc-145細(xì)胞為國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保藏細(xì)胞株。PRRSV為國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保藏毒種。

1.2材料及設(shè)備

1.2.1微載體cytodex 1購自GE公司。用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液清洗并浸泡至少3 h后，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min冷卻后儲于4 ℃密封待用。使用前用37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2遍。

1.2.2試劑細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM購自默克密理博清大天一科技有限公司。新生牛血清購自Gibco公司。配制成含有5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，其中含有100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，經(jīng)無菌0.22 μm膜過濾除菌，4 ℃冷藏備用。胰蛋白酶購自Invitrogen公司，用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液配制成0.25%濃度的胰蛋白酶溶液，調(diào)整pH值至7.5～8.0，經(jīng)無菌0.22 μm膜過濾除菌，4 ℃冷藏備用。

1.2.3設(shè)備5 L動物細(xì)胞反應(yīng)器由華東理工大學(xué)國家生化工程技術(shù)研究中心（上海）制造，反應(yīng)器培養(yǎng)體積范圍1.2～4.0 L，具有溶解氧（DO）、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速及四氣（N2、O2、CO2、空氣）控制系統(tǒng)。

60 L動物細(xì)胞反應(yīng)器由默克密理博北京清大天一科技有限公司制造，反應(yīng)器培養(yǎng)體積為48 L，具有DO、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速及四氣（N2、O2、CO2、空氣）控制系統(tǒng)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.15 L生物反應(yīng)器中Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)分批換液式操作DO電極、pH電極標(biāo)定及罐體安裝完畢，經(jīng)121 ℃高壓滅菌45min及預(yù)培養(yǎng)1 d（無菌檢測）后，用于Marc-145細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)，微載體用量分別為3、6、9 g/L，初始細(xì)胞接種密度均為3×105 cells/mL，培養(yǎng)體積為4 L，利用分批換液式操作，即將培養(yǎng)液、細(xì)胞及微載體一次全部投入進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行換液操作?？刂艱O為50%飽和度，pH值為7.0～7.1，攪拌轉(zhuǎn)速為25～40 r/min，培養(yǎng)溫度為37 ℃。每天從反應(yīng)器中吸取樣品，測定細(xì)胞密度和培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分濃度、代謝副產(chǎn)物濃度等。

不同培養(yǎng)方式的反應(yīng)器預(yù)備安裝、滅菌流程及過程參數(shù)的設(shè)定均同上所述，以下不再贅述。

1.3.25 L生物反應(yīng)器中Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)消化傳代放大式操作初始培養(yǎng)時微載體用量分別2、3 g/L，初始細(xì)胞接種密度為3×105cells/mL，培養(yǎng)體積分別為4 L。經(jīng)過初始培養(yǎng)后，對2、3 g/L的微載體培養(yǎng)物進(jìn)行消化操作，使細(xì)胞從微載體上消化脫落，將消化后的細(xì)胞和舊微載體一并分別接種于16 g和12 g新微載體中，進(jìn)行消化傳代后放大再培養(yǎng)，微載體的終濃度均為6 g/L，培養(yǎng)體積均為4 L。每天從反應(yīng)器中吸取樣品，測定細(xì)胞密度和培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分濃度、代謝副產(chǎn)物濃度等。

1.3.35 L生物反應(yīng)器中Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)循環(huán)灌注式操作微載體用量為6 g/L，初始細(xì)胞接種密度為3.5×105 cells/mL，培養(yǎng)體積為4 L。培養(yǎng)24 h后，開始進(jìn)行循環(huán)灌注操作，操作前期進(jìn)行每天1/2個培養(yǎng)體積的循環(huán)灌注量，隨著培養(yǎng)時間的延長及細(xì)胞生長的加快，將循環(huán)灌注的速率逐步提高至每天1～3個培養(yǎng)體積的循環(huán)灌注量。循環(huán)灌注操作需要安置1個大體積的貯液罐（貯液量10～12 L），通過2個變速蠕動泵及硅膠管道將反應(yīng)器和貯液罐閉環(huán)連接，形成培養(yǎng)液以一定流速從貯液罐中泵入反應(yīng)器的同時，培養(yǎng)液以相同的流速從反應(yīng)器中泵回貯液罐。每天分別從反應(yīng)器和貯液罐中吸取樣品，測定細(xì)胞密度和培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分濃度、代謝副產(chǎn)物濃度等。

通過上述3種操作方式，在5 L動物細(xì)胞反應(yīng)器中最終實(shí)現(xiàn)的都是在6 g/L微載體用量下進(jìn)行Marc-145細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)，比較不同操作方式的培養(yǎng)效能。

1.3.4消化后Marc-145細(xì)胞在60 L生物反應(yīng)器中微載體懸浮培養(yǎng)操作及PRRSV接毒增殖操作經(jīng)消化處理后的Marc-145細(xì)胞檢測細(xì)胞活率，按照初始細(xì)胞密度3.0×105 cells/mL 重新接種于新微載體中，微載體的使用濃度為 3 g/L，培養(yǎng)體積為48 L。設(shè)置細(xì)胞培養(yǎng)過程pH值、DO及溫度為自動控制。培養(yǎng)過程中每天檢測細(xì)胞密度、營養(yǎng)物濃度及代謝副產(chǎn)物的濃度。視培養(yǎng)的具體情況選擇換液或其他操作輔助細(xì)胞生長。

待細(xì)胞密度增長至2×106～3×106 cells/mL進(jìn)行接毒操作，PRRS種毒以MOI=0.05接入微載體懸浮培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞的60 L反應(yīng)器中[9]，接毒后24、48、72 h取樣測定PRRSV的效價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的分批換液式操作

一次性將細(xì)胞和微載體投入反應(yīng)器進(jìn)行懸浮培養(yǎng)是一種常用的簡單培養(yǎng)方式，增加微載體的用量即可增加細(xì)胞生長表面，進(jìn)而收獲更多的細(xì)胞，但試驗(yàn)結(jié)果表明，采用相同的初始細(xì)胞密度3.0×105cells/mL進(jìn)行Marc-145細(xì)胞接種培養(yǎng)，微載體的濃度直接影響最終的培養(yǎng)效果（圖1）。3 g/L的微載體用量可獲得較好的細(xì)胞生長效果，培養(yǎng)3 d通過換液操作使得Marc-145細(xì)胞在培養(yǎng)6 d獲得最大活細(xì)胞密度23.8×105 cells/mL。而9 g/L的微載體用量條件下細(xì)胞不能正常生長，雖然其提供了最大的細(xì)胞生長表面，但3.0×105 cells/mL 的初始接種密度過低，分配在每個微載體上的初始細(xì)胞個數(shù)太少，細(xì)胞生長的延遲期維持了3 d之久，雖然在培養(yǎng)3、6 d進(jìn)行了2次換液操作，細(xì)胞仍然生長緩慢。此外 9 g/L 的微載體濃度使得細(xì)胞培養(yǎng)液的流動性變差，氣體及熱量的傳遞無法按照牛頓流體的線性控制完成，影響了最終的培養(yǎng)效果，同時也說明該生物反應(yīng)器的最大混合能力不能支持動物細(xì)胞在9 g/L的微載體使用濃度上進(jìn)行生長。通過2次換液操作，6 g/L微載體在3.0×105 cells/mL的初始接種密度下，可以達(dá)到27.2×105 cells/mL的最大活細(xì)胞密度；但通過顯微觀察，微載體表面依然有較多的空隙，并沒有達(dá)到細(xì)胞生長的最大效能，這可能就是分批換液式培養(yǎng)工藝的局限性。

2.2Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的消化傳代放大式操作

Marc-145細(xì)胞分別在2 g/L和3 g/L的微載體濃度下

進(jìn)行初始培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后3、4 d通過胰酶消化作用，使得細(xì)胞從微載體上脫落，形成細(xì)胞與微載體的混懸液。該混合物再重新接種于16 g和12 g新微載體中，培養(yǎng)體積均為4 L，進(jìn)行消化傳代后放大再培養(yǎng)，結(jié)果如圖 2所示。該試驗(yàn)的實(shí)際目的就是利用消化傳代的方式將Marc-145細(xì)胞最終接種在6 g/L的微載體用量上進(jìn)行培養(yǎng)（便于在整個研究中作比較），放大比例分別為1 ∶3和1 ∶2。結(jié)果表明，Marc-145細(xì)胞在經(jīng)過消化操作后，細(xì)胞活力有不同程度的損傷，活細(xì)胞密度降低，直接影響了細(xì)胞的重新爬球，使得細(xì)胞重新爬球后再生長的延遲期時間延長，最終最大活細(xì)胞密度在2個放大比例組別中沒有明顯差異，在28×105 cells/mL 左右。該試驗(yàn)說明，利用胰酶消化可以進(jìn)行微載體培養(yǎng)的傳代放大，但其消化工藝需要進(jìn)行優(yōu)化，盡量避免細(xì)胞經(jīng)消化后的活力損傷，影響放大再爬球生長的效果。

2.3Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的循環(huán)灌注式操作

利用循環(huán)灌注的培養(yǎng)方式進(jìn)行Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)前面試驗(yàn)的結(jié)果，適度提高初始接種細(xì)胞密度達(dá)到3.5×105 cells/mL，微載體用量為6 g/L（便于在整個研究中作比較），同時在培養(yǎng)1 d后開始進(jìn)行連續(xù)循環(huán)灌注操作，灌注速率為0.5個培養(yǎng)體積/d，隨著培養(yǎng)時間的延長，灌注速率逐步在培養(yǎng)2～4 d提高到1.0～1.5個培養(yǎng)體積/d，在培養(yǎng)4～7 d提高到1.5～3.0個培養(yǎng)體積/d。通過這種方式，Marc-145細(xì)胞獲得比較好的培養(yǎng)效果，細(xì)胞進(jìn)入快速生長的時間縮短，培養(yǎng)過程中沒有頻繁的罐上操作，利用變速蠕動泵將培養(yǎng)上清進(jìn)行連續(xù)的密閉循環(huán)流動，為細(xì)胞提供相對較好的生長環(huán)境，培養(yǎng)6～7 d活細(xì)胞密度達(dá)到59.4×105 cells/mL，觀察微載體生長表面基本都被細(xì)胞所覆蓋，細(xì)胞層生長致密并維持較高的存活率。

2.43種培養(yǎng)方式條件下Marc-145細(xì)胞在微載體上生長、生理代謝的比較

3種培養(yǎng)方式對Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的生

長、生理代謝產(chǎn)生不同結(jié)果（表1）。細(xì)胞在微載體上展開生長的延遲期長短與初始接種密度和微載體用量的比例有關(guān)，3.0×105 cells/mL的初始細(xì)胞密度對于3 g/L的微載體用量來說是比較適合的，表現(xiàn)為大致13 h的延遲期，提高微載體用量會造成延遲期的延長。如果適當(dāng)提高初始細(xì)胞密度到3.5×105 cells/mL，在6 g/L微載體用量下也可獲得較快的初始生長。

循環(huán)灌注培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞平均倍增時間明顯小于其他2種培養(yǎng)方式，大致為13 h。同時培養(yǎng)周期也僅為最少的6～7 d，即可獲得最大的細(xì)胞密度59.4×105 cells/mL，平均比生長速率0.479 d-1，高于其他組別。

隨著培養(yǎng)時間的延長，考察培養(yǎng)液滲透壓的變化，結(jié)果表明，在經(jīng)過較長時間的利用，雖然營養(yǎng)成分還沒有利用完，換液前或傳代前的培養(yǎng)液滲透壓已經(jīng)達(dá)到或接近400 mOsm/kg，這樣的滲透壓對細(xì)胞生長極為有害，這可能是分批換液培養(yǎng)和消化傳代放大培養(yǎng)不能獲得高密度培養(yǎng)的原因之一。而直到循環(huán)灌注培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)液的滲透壓才達(dá)到391.5 mOsm/kg，因?yàn)槔醚h(huán)灌注及時稀釋了細(xì)胞代謝出的副產(chǎn)物（乳酸和氨），同時也減少了培養(yǎng)過程中為了維持培養(yǎng)pH值而進(jìn)行的補(bǔ)堿用量（NaHCO3），為細(xì)胞生長提供了相對較好的培養(yǎng)環(huán)境。

循環(huán)灌注培養(yǎng)為Marc-145細(xì)胞微載體懸浮生長提供了較好的培養(yǎng)環(huán)境，使得細(xì)胞生長代謝較為旺盛。測定各組別細(xì)胞的營養(yǎng)物和代謝副產(chǎn)物濃度，發(fā)現(xiàn)循環(huán)灌注培養(yǎng)的 Marc-145細(xì)胞對葡萄糖和谷氨酰胺的利用率高于其他組別，表現(xiàn)為葡萄糖比消化速率為2.065 mmol/（109 cells·d），谷氨酰胺比消耗速率為0.174 mmol/（109 cells·d），均高于其他組別，同時乳酸對葡萄糖的得率系數(shù)為1.228 mmol/mmol，低于其他組別，說明Marc-145細(xì)胞在循環(huán)灌注培養(yǎng)過程中能夠充分利用營養(yǎng)物，同時其代謝副產(chǎn)物乳酸的生成較少，葡萄糖代謝途徑部分減弱了乳酸生成的通量，而轉(zhuǎn)向用于生理代謝和細(xì)胞生物量的增加，進(jìn)而表現(xiàn)為細(xì)胞對葡萄糖和谷氨酰胺的得率系數(shù)提高，分別達(dá)到0.081×109 cells/mmol和 0.958×109 cells/mmol，均高于其他組別。

2.5Marc-145細(xì)胞微載體一級、二級懸浮培養(yǎng)及PRRSV接毒增殖全過程

根據(jù)上述研究結(jié)果，設(shè)計(jì)出Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)、消化傳代放大、PRRSV接毒增殖的全過程：（1）Marc-145細(xì)胞凍存細(xì)胞復(fù)蘇之后，經(jīng)2～3代的滾瓶擴(kuò)增，接種至5 L動物細(xì)胞反應(yīng)器，提高微載體的用量為6 g/L，采用循環(huán)灌注的培養(yǎng)方式進(jìn)行一級培養(yǎng)，在短時間內(nèi)獲得高密度的Marc-145細(xì)表13種培養(yǎng)方式條件下Marc-145細(xì)胞在微載體上生長、生理代謝的比較

項(xiàng)目Marc-145細(xì)胞不同培養(yǎng)模式分批換液培養(yǎng)消化傳代放大培養(yǎng)循環(huán)灌注培養(yǎng)3 g/L6 g/L2～6 g/L3～6 g/L6 g/L延遲期持續(xù)時間（h）131822（消化后）22（消化后）16平均倍增時間（h）1821212013接種細(xì)胞密度（×105 cells/mL）3.03.03.03.03.5最大細(xì)胞密度（×105 cells/mL）23.8±1.227.2±1.127.2±1.128.7±1.259.4±1.8細(xì)胞平均比生長速率（d-1）0.346±0.0140.312±0.0110.271±0.0120.284±0.0090.479±0.008培養(yǎng)周期（d）6～77～88～98～96～7培養(yǎng)液總量（L）812121216滲透壓（mOsm/kg）換液前或傳代前413.8387.3390.1395.4培養(yǎng)結(jié)束400.7409.4401.1405.8391.5葡萄糖比消耗速率[mmol/（109 cells·d）]1.791±0.0021.885±0.0061.872±0.0051.891±0.0072.065±0.005谷氨酰胺比消耗速率[mmol/（109 cells·d）]0.157±0.000 50.143±0.000 50.142±0.000 60.159±0.000 50.174±0.000 6乳酸比生成速率[mmol/（109 cells·d）]2.474±0.0042.628±0.0032.580±0.0052.619±0.0092.536±0.004氨比生成速率[mmol/（109 cells·d）]0.116±0.0020.115±0.0010.105±0.0010.118±0.0030.078±0.001乳酸對葡萄糖的得率系數(shù)（mmol/mmol）1.381±0.0021.394±0.0031.378±0.0021.385±0.0021.228±0.001細(xì)胞對葡萄糖的得率系數(shù)（×109 cells/mmol）0.079±0.0010.076±0.0020.067±0.0020.066±0.0040.081±0.003細(xì)胞對谷氨酰胺的得率系數(shù)（×109 cells/mmol）0.909±0.0010.874±0.0020.880±0.0020.789±0.0020.958±0.003

胞種子細(xì)胞，達(dá)到50×105 cells/mL，并保持較高的細(xì)胞存活率。（2）采用消化傳代操作工藝，使得種子細(xì)胞從舊微載體上脫落、分散，直接接入60 L動物細(xì)胞反應(yīng)器中，與新微載體及新鮮培養(yǎng)液混合均勻，完成消化放大過程。整個消化及轉(zhuǎn)移放大過程在30 min內(nèi)完成。（3）在60 L動物細(xì)胞反應(yīng)器中，微載體用量為3 g/L，培養(yǎng)體積為45～50 L，采用分批式培養(yǎng)方式，根據(jù)細(xì)胞實(shí)際生長情況，適度更換培養(yǎng)液可完成Marc-145細(xì)胞的60 L反應(yīng)器二級微載體懸浮培養(yǎng)過程，細(xì)胞密度達(dá)到25×105～30×105 cells/mL即可進(jìn)行PRRSV接毒操作。以MOI=0.05進(jìn)行PRRSV接毒，完成PRRSV的增殖過程，在接毒后2 d收毒，獲得最大增殖毒價(jià)為108.3 TCID50/mL（圖4）。整個5 L→60 L Marc-145細(xì)胞放大培養(yǎng)及PRRS病毒增殖過程控制在12 d左右，生產(chǎn)周期較短，操作簡單。接毒前和接毒后細(xì)胞在微載體上生長形態(tài)如圖5所示。

3討論

動物細(xì)胞進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)，其貼壁型生長特性沒有改變，所以在分批式培養(yǎng)中提高微載體的用量，供應(yīng)更大的細(xì)胞生長表面，即可獲得更高的細(xì)胞密度。但對于類似Marc-145細(xì)胞這樣對初始細(xì)胞密度有一定依賴性的細(xì)胞，過度提高微載體用量會造成細(xì)胞無法正常啟動生長，使得細(xì)胞生長的延遲期大大延長，培養(yǎng)周期也隨之延長，在培養(yǎng)后期無法獲

得較好的培養(yǎng)效果。此外，每臺攪拌式生物反應(yīng)器的混合供氧效能是基本一定的，即在細(xì)胞能夠忍受的最大攪拌和通氣條件下，其攪拌混合微載體培養(yǎng)物的能力是一定的，盲目提高微載體的用量會使得培養(yǎng)環(huán)境中攪拌混合的效果變差，直接導(dǎo)致傳氧、傳質(zhì)的效果變差，細(xì)胞無法正常生長。所以選用適宜的微載體用量及與之相匹配的細(xì)胞初始接種密度，可以獲得較好的培養(yǎng)效果，同時也縮短培養(yǎng)周期。

消化傳代放大培養(yǎng)方式模擬了工業(yè)生產(chǎn)中細(xì)胞培養(yǎng)放大再培養(yǎng)的過程，如何讓細(xì)胞從舊微載體表面有效脫落，并保持再次“爬球生長”的能力，進(jìn)一步在新微載體上黏附生長是微載體培養(yǎng)工程放大的難點(diǎn)[10]。文獻(xiàn)表明，利用“球到球”的傳代方式，細(xì)胞不通過消化脫落，而是直接讓細(xì)胞從舊微載體以“細(xì)胞橋”的方式向新微載體上轉(zhuǎn)移[11]，雖然可以有部分細(xì)胞能夠完成此種放大過程，但其放大效率不高，放大比率有限，一般是1 ∶1或1 ∶2進(jìn)行放大[12]，同時也造成較高的“空球率”，培養(yǎng)效果不佳，浪費(fèi)培養(yǎng)資源[13]。采用胰酶消化的方式，將細(xì)胞從微載體上消化下來后，再與新微載體混合重新黏附，可以使得傳代后的細(xì)胞均勻黏附于新微載體表面，充分利用生長空間，可獲得較好的培養(yǎng)效果。

循環(huán)灌注培養(yǎng)方式是傳統(tǒng)灌注培養(yǎng)方式的一種優(yōu)化方式[14]。傳統(tǒng)的灌注培養(yǎng)方式是指在新鮮培養(yǎng)液流入的同時，用過的培養(yǎng)液以相同的速度流出。該方式雖然可以獲得不錯的培養(yǎng)效果，但存在諸多弊端，如新鮮培養(yǎng)液的利用率不高，細(xì)胞在沒有完全利用完培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分時可能已經(jīng)被抽離出反應(yīng)器造成浪費(fèi)；培養(yǎng)液預(yù)備量較大的同時，廢液處理量也較大，通常在傳統(tǒng)灌注培養(yǎng)周期內(nèi)會造成10～20倍培養(yǎng)體積的液體處理量[15]。而循環(huán)灌注方式完全克服了傳統(tǒng)灌注方式的缺點(diǎn)，灌注量僅為培養(yǎng)體積的3倍，通過控制灌注液的灌注速率配合細(xì)胞的生長速率，供應(yīng)充足的營養(yǎng)，并有效稀釋代謝副產(chǎn)物的濃度，細(xì)胞的培養(yǎng)效果在本研究3種培養(yǎng)工藝中是最好的。

根據(jù)本研究中3種培養(yǎng)方式的特點(diǎn)及從5 L反應(yīng)器至 60 L 反應(yīng)器規(guī)模放大的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果，可以設(shè)計(jì)出如下工藝流程：（1）Marc-145細(xì)胞的種子培養(yǎng)可以在小規(guī)模的生物反應(yīng)器（15～30 L）中進(jìn)行高微載體用量的循環(huán)灌注培養(yǎng)，充分利用微載體的生長表面，在較短的時間內(nèi)能夠獲得最多的種子細(xì)胞，為放大培養(yǎng)規(guī)模提供細(xì)胞準(zhǔn)備。（2）利用胰酶消化傳代工藝進(jìn)行種子細(xì)胞的傳代放大，通過至少1 ∶3的放大比例將種子接種于60～120 L動物細(xì)胞反應(yīng)器中進(jìn)行再培養(yǎng)。（3）在傳代放大后，控制Marc-145細(xì)胞的接種細(xì)胞密度，維持細(xì)胞與微載體之間合適的接觸比例，采用分批換液的培養(yǎng)方式，簡化反應(yīng)罐上操作及所需設(shè)備，使得細(xì)胞均勻分布在微載體表面，迅速生長，達(dá)到接毒要求，進(jìn)行病毒增殖。上述流程已在該疫苗生產(chǎn)企業(yè)得到實(shí)際應(yīng)用，企業(yè)生產(chǎn)過程數(shù)據(jù)未標(biāo)出。

綜上所述，本研究比較了3種培養(yǎng)方式對Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的實(shí)際效能，由此制定并實(shí)施可能的應(yīng)用流程，為我國PRRS疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了研究基礎(chǔ)。

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