王慶容++王福群

摘要：從患病鱖魚鰓部分離到1個(gè)菌株，通過分子鑒定和形態(tài)鑒定，初步鑒定為埃里格孢（Embellisia allii）。將該菌株在不同溫度和不同pH值條件下培養(yǎng)，根據(jù)二者對(duì)其生長(zhǎng)速率的影響來進(jìn)行生物學(xué)特性初步研究；再以草魚和鯉魚為感染對(duì)象，用該菌進(jìn)行回復(fù)感染，對(duì)其致病性作初步研究。結(jié)果表明：埃里格孢在pH值為5.0～11.0下均能生長(zhǎng)，以pH值為9.0～11.0時(shí)生長(zhǎng)最佳；在5～35 ℃時(shí)，該菌都能生長(zhǎng)，以20 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，溫度為40 ℃時(shí)該菌幾乎不能生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)室條件下，單一菌株對(duì)草魚和鯉魚不具有致病性。

關(guān)鍵詞：埃里格孢（Embellisia allii）；生物學(xué)特性；致病性；鱖魚；草魚；鯉魚

中圖分類號(hào)： S941.43文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0269-03

收稿日期：2015-01-29

基金項(xiàng)目：貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目[編號(hào)：黔科合人才團(tuán)隊(duì)（2012）4004]；貴州省遵義市科技項(xiàng)目[編號(hào)：遵市科合社字（2009）26號(hào)]。

通信作者：王慶容（1972—），女，貴州遵義人，教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物分子生物學(xué)、養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的中草藥防治。E-mail：610194977@qq.com。埃里格孢（Embellisia allii）屬于暗色磚格分生孢子真菌埃里格孢屬，它可以寄生于大蒜鱗莖，引起黑褐色病斑，后期病斑凹陷失水干燥，表面密生黑色霉層，菌絲體表生至埋生；在PDA和PCA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落呈正圓形、黑色，產(chǎn)生大量分生孢子，菌絲部分細(xì)胞可膨大形成厚垣孢子。其分生孢子在水中，25 ℃下4 h左右即可萌發(fā)。萌發(fā)時(shí)主要從兩端細(xì)胞開始，也可以從中間細(xì)胞開始，萌發(fā)芽管生長(zhǎng)迅速，48 h 左右萌發(fā)的芽管即可分化形成菌絲或次生分生孢子梗，產(chǎn)生次生分生孢子。萌發(fā)的分生孢子細(xì)胞可產(chǎn)生1至數(shù)個(gè)芽管，分生孢子梗亦可萌發(fā)產(chǎn)生芽管，亦可很快轉(zhuǎn)變成次生分生孢子梗[1]。

埃里格孢通常是從植物體表分離，本研究首次從患病鱖魚鰓部分離到，未見從其他動(dòng)物體表分離到的報(bào)道。通過不同溫度和不同pH值對(duì)其生長(zhǎng)速率影響來進(jìn)行生物學(xué)特性初步研究后，再以草魚和鯉魚為感染對(duì)象，用該菌進(jìn)行回復(fù)感染，對(duì)其致病性進(jìn)行初步研究，進(jìn)一步了解埃里格孢對(duì)動(dòng)物的影響。

1材料與方法

1.1材料

從鱖魚的鰓部分離到的菌株，在PDA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)，將純培養(yǎng)的菌種保存于4 ℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1菌株的分離鑒定提取菌株DNA，擴(kuò)增其18S rRNA基因。擴(kuò)增使用的引物是通用引物NS1與NS6[2]，將菌株的18S rRNA基因序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中，查找相似菌種。將真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng) 3～12 d，每天觀察菌落形態(tài)與顏色。再在顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，分生孢子梗著生情況，孢子形態(tài)、大小與顏色等。采用分子鑒定和形態(tài)鑒定方法與步驟，具體步驟見文獻(xiàn)[3]。

1.2.2不同pH值對(duì)埃里格孢的影響供試pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的PDA平板，共7個(gè)處理，平行做3次。切取菌齡一致的菌餅（直徑8 mm），將其置于平板中央，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，觀察并記錄菌落的生長(zhǎng)速率，培養(yǎng)24 h后采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑[4]，試驗(yàn)周期為7 d。

1.2.3不同溫度對(duì)埃里格孢的影響供試溫度為5、10、15、20、25、30、35、40 ℃共8個(gè)溫度梯度，平行培養(yǎng)3次，切取菌齡一致的菌餅（直徑8 mm），將其置于平板中央，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，觀察并記錄菌落的生長(zhǎng)速率，培養(yǎng)24 h后采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，試驗(yàn)周期為7 d。

1.2.4埃里格孢的致病性用埃里格孢回復(fù)感染草魚和鯉魚，提前買一批供試魚，等到供試魚在自然條件下生長(zhǎng)穩(wěn)定，開始進(jìn)行回復(fù)感染。將魚分裝到養(yǎng)魚箱中，每箱數(shù)量為10尾，平行做3次，1箱對(duì)照組，2箱試驗(yàn)組。對(duì)照組不進(jìn)行任何處理；試驗(yàn)組用浸泡法（在魚的胸鰭處用小刀割1個(gè)3～5 cm長(zhǎng)的小口，將PDA平板上生長(zhǎng)的埃里格孢菌絲和分生孢子用刷子刷入養(yǎng)魚箱中）和涂抹法（在魚的胸鰭處用小刀割1個(gè)3～5 cm長(zhǎng)的小口，用滅菌棉簽沾取埃里格孢的分生孢子涂抹于傷口處）處理草魚和鯉魚，試驗(yàn)周期為15 d，觀察埃里格孢的致病性。

2結(jié)果與分析

2.1埃里格孢的鑒定結(jié)果

將菌株的18S rRNA基因序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)過用Blast工具比對(duì)，該菌株屬于埃里格孢屬。

經(jīng)過形態(tài)觀察，菌絲體表生至埋生；菌絲無色，具隔膜，壁光滑，寬2～4 μm。分生孢子梗直或彎曲，簡(jiǎn)單或具分枝，褐色至暗褐色，具隔膜，長(zhǎng)達(dá)70 μm，寬6～8 μm，在上端產(chǎn)孢處屈膝狀彎曲，具多個(gè)產(chǎn)孢孔，內(nèi)壁芽生孔式產(chǎn)孢，合軸式延伸。產(chǎn)孢細(xì)胞單芽生至多芽生、合生，圓柱狀，褐色。分生孢子淡褐色至褐色，單生，壁光滑，倒卵形、卵圓形、橢圓形或近圓柱形，直或形成各種彎曲，呈“乙”形或“S”形等，中間略粗、兩端稍細(xì)，具多個(gè)橫隔膜（通常3～6個(gè)），橫隔膜加厚、色深，分隔處略隘縮，似桶箍狀。偶有縱隔膜或斜隔膜，孢子脫落痕明顯，（30～40） μm×（10～12） μm，可形成次生分生孢子梗（圖1-a）。

分生孢子在水中，25 ℃時(shí)4 h左右即可萌發(fā)，主要從兩端細(xì)胞萌發(fā)，也可從中間細(xì)胞萌發(fā)，萌發(fā)芽管生長(zhǎng)迅速，48 h左右萌發(fā)的芽管即可分化形成菌絲或次生分生孢子梗，從上產(chǎn)

生次生分生孢子。次生分生孢子可繼續(xù)萌發(fā)產(chǎn)生細(xì)的芽管，其表面常生細(xì)小的疣突。萌發(fā)的分生孢子細(xì)胞可產(chǎn)生1至數(shù)個(gè)芽管，分生孢子梗亦可萌發(fā)產(chǎn)生芽管，多數(shù)再很快轉(zhuǎn)變成次生分生孢子梗（圖1-b）。

依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定為絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Moniliales）埃里格孢屬（Embellisia）埃里格孢（Embellisia allii）[5]。

2.2不同pH值對(duì)埃里格孢生長(zhǎng)速率的影響

在不同pH值條件下培養(yǎng)，觀察pH值對(duì)埃里格孢生長(zhǎng)的影響。由圖2和表1可見，埃里格孢在pH值為5.0～11.0均能生長(zhǎng)，差異極顯著（P<0.01）（SPSS軟件的單樣本t檢驗(yàn)），表明pH值對(duì)埃里格孢的生長(zhǎng)影響非常明顯。由表1可見，pH值為9.0、10.0和11.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率相對(duì)較快，分別為34.45、36.38、36.56 mm/d。

2.3不同溫度對(duì)埃里格孢的影響

在不同溫度條件下培養(yǎng)，觀察溫度對(duì)埃里格孢生長(zhǎng)的影響。由表2、圖3可見，在5～20 ℃溫度范圍內(nèi)，菌絲生長(zhǎng)速度隨溫度升高而增大；在20～35 ℃溫度范圍內(nèi)，菌絲生長(zhǎng)速率隨溫度升高而減慢。用SPSS軟件的進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)，差異極顯著（P<0.01），表明溫度對(duì)埃里格孢的生長(zhǎng)影響非常明顯。25 ℃和30 ℃生長(zhǎng)速率相差不大，菌斑分別達(dá)30.74 mm/d和30.57 mm/d，20 ℃生長(zhǎng)最快，達(dá)38.83 mm/d，可視為最適溫度。

2.4埃里格孢的致病性

用浸泡法和涂抹法回復(fù)感染草魚和鯉魚，15 d之后，試驗(yàn)組的魚身上沒有發(fā)現(xiàn)明顯的感染癥狀。

取材進(jìn)行再培養(yǎng)，沒有發(fā)現(xiàn)埃里格孢，初步判斷埃里格孢對(duì)草魚和鯉魚無感染能力，單一菌株的埃里格孢可能對(duì)淡水魚無致病性。

3討論

對(duì)從患病鱖魚身上分離的埃里格孢進(jìn)行生物學(xué)特性的初步研究，將菌株接種到不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，于溫度25 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)pH值為9.0～11.0時(shí)，埃里格孢的生長(zhǎng)速率較快（表1）。將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度下恒溫培養(yǎng)，在溫度5～20 ℃范圍內(nèi)，菌絲生長(zhǎng)速率隨溫度升高而增大；溫度20～35 ℃內(nèi)，菌絲生長(zhǎng)速率隨溫度升高而減小，差異極顯著；25 ℃和30 ℃生長(zhǎng)速度相差不大，20 ℃時(shí)埃里格孢生長(zhǎng)最快，40 ℃時(shí)菌絲幾乎不生長(zhǎng)（表2）。

陳偉群等報(bào)道埃里格孢寄生于大蒜鱗莖，引起黑褐色病斑，后期病斑凹陷失水干燥，表面密生黑色霉層[5]，但該菌是否致病于動(dòng)物還未查到相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)是針對(duì)從鱖魚鰓部分離的埃里格孢通過不同溫度和不同pH值對(duì)它的生長(zhǎng)影響來進(jìn)行生物學(xué)特性初步研究后，再以草魚和鯉魚為感染對(duì)象，用該菌進(jìn)行回復(fù)感染，對(duì)其致病性作初步研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，15 d之后，試驗(yàn)組的魚身上沒有發(fā)現(xiàn)真菌埃里格孢，所以埃里格孢對(duì)草魚和鯉魚可能沒有致病性。

據(jù)張?jiān)滦堑葓?bào)道，常見的真菌性魚病有水霉病、鰓霉病2種[6]。魚在換水或搬運(yùn)時(shí)體表受傷，局部皮膚壞死，水霉菌便乘機(jī)入侵，主要癥狀為病變部位長(zhǎng)著大量棉絮狀的菌絲，像一團(tuán)團(tuán)的毛，魚體由于負(fù)擔(dān)過重，游動(dòng)失常，食欲減退，甚至?xí)萑醵?。鰓霉病主要癥狀為病魚鰓部呈蒼白色，有時(shí)有點(diǎn)狀充血或出血現(xiàn)象，此病常出現(xiàn)暴發(fā)性急劇死亡。埃里格孢單獨(dú)回復(fù)感染草魚和鯉魚可能不病致，但與其他真菌一起能否引起魚類致病還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，該株埃里格孢是從患病鱖魚的鰓部分離到的，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性及致病性初步研究，可以了解該真菌是否對(duì)淡水魚具有致病性，在什么條件下會(huì)致病，從而為養(yǎng)殖魚類的真菌性疾病防治提供理論依據(jù)，具有很重要的理論意義和適用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]張?zhí)煊? 中國真菌志：第31卷暗色磚格分生孢子真菌26屬[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009：60-62.

[2]周小玲，沈微，饒志明，等. 一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（4）：89-92.

[3]魏福倫，朱里鵬，王慶容. 3株鱸魚體表可疑性致病真菌的分離鑒定與生物學(xué)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：187-190.

[4]董國菊，申晚霞. 重慶地區(qū)玉米圓斑病菌生物學(xué)特性的測(cè)定[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，32（12）：8-13.

[5]陳偉群，張?zhí)煊? 中國一新紀(jì)錄屬——埃里格孢屬（Embellisia）[J]. 真菌學(xué)報(bào)，1996，15（2）：152-153.

[6]張?jiān)滦? 觀賞魚真菌性疾病和寄生蟲病的中草藥治療[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，2002（4）：187-188.劉思思，高旋旋，胡竹青，等. 鎘誘導(dǎo)錦鯉腎臟氧化性DNA損傷及谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)改變[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：272-274.