楊旭 ，趙海洲，徐大德，羅展遠(yuǎn)，朱晶，劉文華，貝偉劍

(1.廣東藥學(xué)院 中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006; 2.肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

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何首烏提取物對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

楊旭1，趙海洲2，徐大德2，羅展遠(yuǎn)1，朱晶1，劉文華2，貝偉劍1

(1.廣東藥學(xué)院 中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006; 2.肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

摘要:目的 研究何首烏提取物對(duì)1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法 體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，建立MPP+致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、MPP+損傷模型組、何首烏提取物干預(yù)組。干預(yù)組在MPP+損傷的基礎(chǔ)上，給予不同濃度何首烏提取物(終質(zhì)量濃度5、25、100 mg/L)。MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力；Hoechst33258染色和白光下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)及細(xì)胞中丙二醛(MDA)含量；通過熒光強(qiáng)度觀察活性氧(ROS)的含量和線粒體膜電位的變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組中細(xì)胞活性顯著降低，Hoechst33258染色和白光下可見細(xì)胞胞體變小、核皺縮、碎裂有明顯的顆粒狀和固縮狀熒光，并且細(xì)胞上清液中LDH泄漏明顯增多、細(xì)胞中MDA含量和ROS顯著升高而線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，預(yù)先4 h給予不同濃度的何首烏提取物(5、25、100 mg/L)能明顯改善SH-SY5Y細(xì)胞的活性，降低細(xì)胞產(chǎn)生的LDH、MDA含量，并恢復(fù)線粒體膜高能電位,且對(duì)ROS有明顯的抑制效果(P<0.01)。結(jié)論 何首烏提取物對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，其保護(hù)作用與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞:何首烏提取物； SH-SY5Y細(xì)胞； MPP+細(xì)胞損傷； 神經(jīng)保護(hù)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病。主要病理特征的改變是黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺神經(jīng)元的缺失[1]。其臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)反射障礙等[2]。迄今為止PD發(fā)生的機(jī)理還不是很清楚，一般認(rèn)為線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、神經(jīng)炎癥等是PD發(fā)生的主要因素[3]。目前臨床用于治療PD的藥物均只對(duì)發(fā)病過程中的某一或某幾個(gè)環(huán)節(jié)起效，且副作用大。中藥在防治PD等老年性疾病方面有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，且毒性相對(duì)較小，越來越受到醫(yī)藥界的關(guān)注和推崇[4]。

傳統(tǒng)中藥何首烏Fallopiamultiflora(Thunb.) Harald.常以生首烏或制首烏入藥，生首烏味苦、甘、澀、微溫,具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便之功效。生首烏經(jīng)炮制后即成為制首烏,制首烏味苦、甘、澀、微溫,歸肝、心、腎經(jīng),具有補(bǔ)肝腎、益精血、壯筋骨、烏須發(fā)、化濁降脂之效。有研究表明何首烏具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。本研究擬通過1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的PD模型探討何首烏提取物(extract ofPolyyonummultiflorm,EPM)對(duì)其是否具有保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，為尋找安全有效的中藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與儀器

SH-SY5Y細(xì)胞株購自中山大學(xué)細(xì)胞庫；何首烏藥材購自廣州致信藥業(yè)有限公司,經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院曾令杰教授鑒定為中藥材何首烏；胰酶、FBS、L-Glutamine(100×，GIBCO)；青鏈霉素混合液(100×，北京索萊寶)；PBS(Hycione)；MPP+、MTT(Sigma)；Hochest33258(Roche)；丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(南京建成)；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(碧云天)。

2方法

2.1EPM的制備及成分分析

稱取1 000 g何首烏藥材，粉碎過24目篩，加10倍藥材量的50%(φ)乙醇，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液。提取液用300目篩過濾，然后濃縮至約1 mL/g。濃縮液再過大孔樹脂吸附，用6倍柱體積70%(φ)乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后60 ℃真空干燥48 h。得EPM后采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)和用二甲基亞砜(DMSO，體積分?jǐn)?shù)<0.01%)溶解，用DMEM培養(yǎng)液配成各濃度用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將SH-SY5Y細(xì)胞接種于DMEM完全培養(yǎng)基(10%FBS、1%青鏈霉素混合液、1%L-Glutamine)中、于5%(φ)CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，2～3 d更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%時(shí)按1∶2～1∶3進(jìn)行傳代。選取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分成對(duì)照組(加入干預(yù)組等量的無血清的DMEM培養(yǎng)液)、MPP+損傷模型組、EPM低、中、高劑量組(終質(zhì)量濃度5、25、100 mg/L)。

2.3細(xì)胞形態(tài)觀察

SH-SY5Y細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液后，分別以2×105/孔和5×104/孔的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板及放有玻片(多聚賴氨酸包被過夜)的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后以不同濃度的EPM(5、25、100 mg/L)預(yù)培養(yǎng)4 h，4 h后加0.5 mmol/L MPP+培養(yǎng)48 h。6孔板細(xì)胞在倒置顯微鏡白色光視野下觀察、拍照。24孔板細(xì)胞吸去培養(yǎng)液后，用PBS清洗3遍。加入新鮮的4%(φ)多聚甲醛固定10 min。PBS清洗3遍后加入5 mg/L的Hoechst33258染色液，室溫作用10 min后用PBS漂洗，然后封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.4MTT法對(duì)細(xì)胞活性的檢測(cè)

SH-SY5Y細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液后，以1×104/孔細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。分別給予不同濃度的MPP+后在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h，確定MPP+的最佳濃度和時(shí)間。為了檢測(cè)EPM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響，并確定提取物的無毒濃度范圍，選用了1～500 mg/L之間的8個(gè)濃度點(diǎn)，作用于SH-SY5Y細(xì)胞48 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h時(shí)加入5 mg/L的MTT置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO。置于搖床(45 r/min)上震蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值(A)。通過比較來確定最佳的MPP+的給藥濃度、時(shí)間和EPM最適的給藥濃度范圍。設(shè)對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)率為100%，模型組和干預(yù)組的細(xì)胞存活率用以下公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

2.5比色法檢測(cè)細(xì)胞中MDA和上清液中LDH含量

SH-SY5Y細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，不同濃度的EPM(5、25、100 mg/L)預(yù)培養(yǎng)4 h，4 h后加0.5 mmol/L MPP+培養(yǎng)48 h。分別按MDA和LDH測(cè)定試劑盒說明書操作，比色法測(cè)定細(xì)胞中MDA和細(xì)胞上清液中LDH水平。

2.6細(xì)胞ROS的檢測(cè)

SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于放有玻片(多聚賴氨酸包被過夜)的24孔培養(yǎng)板中，不同濃度的EPM(5、25、100 mg/L)預(yù)培養(yǎng)4 h，4 h后加0.5 mmol/L MPP+培養(yǎng)48 h。用10 μmol/L的DCFH-DA工作液作用于細(xì)胞。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清的培養(yǎng)基清洗3次。熒光顯微鏡拍照并測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

2.7細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于放有玻片(多聚賴氨酸包被過夜)的24孔培養(yǎng)板中，不同濃度的EPM(5、25、100 mg/L)預(yù)培養(yǎng)4 h，4 h后加0.5 mmol/L MPP+培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次。加入0.5 mL無血清的培養(yǎng)基和0.5 mL的JC-1工作液混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。結(jié)束后，用JC-1染色緩沖液洗滌2次。用熒光顯微鏡拍照測(cè)定其熒光強(qiáng)度。計(jì)算紅色與綠色熒光比值。

2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3結(jié)果

3.1EPM的成分分析

1 000 g何首烏藥材經(jīng)過上述工藝處理后得EPM 95 g。經(jīng)HPLC檢測(cè)EPM含二苯乙烯苷29.5%，游離蒽醌2.1%，結(jié)合蒽醌5.2%。見圖1。

1000750500250-20014001020304050600t/min

峰4.二苯乙烯苷； 峰5.蘆薈大黃素； 峰6.大黃酸； 峰7.大黃素； 峰8.大黃酚； 峰9.大黃素甲醚； 紅色1為二苯乙烯苷+總蒽醌混合對(duì)照品圖； 黑色2為EPM樣品圖。

圖1何首烏提取物HPLC特征圖譜

Figure 1HPLC specific chromatogram of EPM

3.2細(xì)胞形態(tài)觀察

在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，傳代的SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)4 h左右貼壁，起初呈梭型或橢圓形，24 h后胞體出現(xiàn)樹枝狀突起，胞體圓潤(rùn)且胞間的突起相互連接。經(jīng)0.5 mmol/L MPP+作用48 h后，模型組細(xì)胞胞體變小，出現(xiàn)小斑點(diǎn)，軸突消失，細(xì)胞皺縮。與模型組相比，EPM干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)得到明顯改善，并呈一定劑量依賴性，高劑量組細(xì)胞形態(tài)接近于對(duì)照組。通過Hoechst 33258染色比較，對(duì)照組呈現(xiàn)出低強(qiáng)度均勻彌散的藍(lán)色熒光，細(xì)胞核邊緣整齊；模型組細(xì)胞核皺縮、凝聚和碎裂，并呈現(xiàn)出亮藍(lán)色的典型凋亡小體；與模型組比較，EPM低、中、高劑量組的細(xì)胞核形態(tài)得到明顯改善，核固縮和亮藍(lán)色的凋亡小體減少，其中高劑量組的細(xì)胞核形態(tài)與對(duì)照組形態(tài)更為接近。見圖2。

3.3MTT法對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的檢測(cè)

3.3.1MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷所需濃度和時(shí)間的確定與對(duì)照組比較，不同濃度的MPP+藥物均可對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞有不同程度的抑制作用，隨著MPP+藥物濃度和時(shí)間的增加，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，結(jié)果見表1。經(jīng)0.5 mmol/L MPP+作用48 h后，細(xì)胞存活率下降至對(duì)照組的44.7%，本實(shí)驗(yàn)用此濃度和作用時(shí)間作為模型組建立條件。

A～E為白光下的細(xì)胞形態(tài)圖； F～J是經(jīng)過Hoechst 33258染色后熒光拍攝圖。

A、F. 對(duì)照組； B、G. 模型組； C、H. 低劑量組； D、I. 中劑量組； E、J. 高劑量組。

圖2各組SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

Figure 2Morphology of SH-SY5Y cells in each group

3.3.2EPM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響和對(duì)照組相比，提取物在1～100 mg/L濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響，表明提取物低于100 mg/L是安全濃度范圍。而200、500 mg/L的提取物作用后，細(xì)胞存活率下降至約65%，表明達(dá)到200 mg/L濃度會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用(圖3)。因此下面的實(shí)驗(yàn)中選用5、25、100 mg/L 3個(gè)劑量來檢測(cè)提取物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用。

表1不同濃度的MPP+24 h和48 h對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

Table 1Effect of MPP+at different concentrations on cell viability at 24 and 48 h

組別c/(mmol·L-1)細(xì)胞存活率/%24h48h對(duì)照組-100±0.5100±0.4 MPP+組0.187.7±0.374.6±1.2**0.2580.1±0.2*63.0±0.80.579.7±0.2*44.7±0.6*175.9±0.3**32.1±0.3**277.9±0.1**30.0±0.2*547.5±0.3**23.8±0.7*

與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

120100806040200細(xì)胞存活率/%10020050015102550對(duì)照組ρ(EPM)/(mg?L-1)

圖3不同濃度的EPM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

Figure 3 Effect of EPM on the viability of SH-SY5Y cells

3.3.3EPM物對(duì)MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用模型組SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)0.5 mmol/L MPP+作用24 h后，細(xì)胞存活率下降至對(duì)照組的44.7%。與模型組相比，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)顯著提高SH-SY5Y細(xì)胞存活率，分別為63.8%、76.1%、88.9%(圖4)。提示EPM在一定濃度范圍內(nèi)能劑量相關(guān)地改善MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活性。

3.4EPM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞MDA水平的抑制作用

與對(duì)照組比較，模型組中SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)過0.5 mmol/L MPP+處理之后，細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著升高(P<0.01)，約為對(duì)照組的2.2倍。和模型組比較，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)能顯著降低SH-SY5Y細(xì)胞中MDA水平，分別為模型組的85.0%、75.0%(P<0.05)和60.0%(P<0.01)(圖5A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在一定濃度范圍內(nèi)EPM能夠抑制MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞MDA水平升高，并具有劑量依賴性。

120100806040200細(xì)胞存活率/%對(duì)照組模型組525100ρ(EPM)/(mg?L-1)

與對(duì)照組比較：*P<0.01，與模型組比較：#P<0.05。

圖4EPM對(duì)MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

3.5EPM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞LDH水平的抑制作用

與對(duì)照組比較，模型組中SH-SY5Y細(xì)胞LDH水平升高至對(duì)照組的1.8倍(P<0.01)。與模型組比較，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)能顯著降低SH-SY5Y細(xì)胞中LDH水平，分別下降至模型組的88.8%、86.2%(P<0.05)和69.3%(P<0.01)(圖5B)。由此可見，EPM能夠劑量依賴性抑制MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞LDH水平上升。

3.6EPM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

各組細(xì)胞運(yùn)用熒光探針DCFH-DA裝載之后，與對(duì)照組相比，模型組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)二氯熒光素(DCF)信號(hào)顯著增強(qiáng)，ROS的水平大幅度的增加，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，與模型組相比，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)可明顯抑制MPP+損傷的細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，熒光強(qiáng)度明顯降低(圖6)。結(jié)果表明，EPM能有效抑制MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升。

3.7EPM對(duì)MPP+誘導(dǎo)的線粒體膜電位的影響

JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針，在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光。在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測(cè)線粒體膜電位的變化。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中的熒光顏色顯著變?yōu)榫G色，表明線粒體膜電位下降，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)與模型組比較，紅色熒光增強(qiáng)，綠色熒光減弱，且呈劑量依賴性(圖7)，表明EPM能明顯抑制MPP+引起的線粒體膜電位下降，進(jìn)而修復(fù)MPP+誘導(dǎo)損傷的線粒體。

250200150100500MDA含量百分比/%對(duì)照組模型組525100200180160140120100806040200LDH泄漏百分比/%對(duì)照組模型組525100ρ(EPM)/(mg?L-1)ρ(EPM)/(mg?L-1)BA

與對(duì)照組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.05。

A. EPM抑制MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞MDA升高；

B. EPM物抑制MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞LDH泄漏增加。

圖5EPM抑制MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞MDA升高和LDH泄漏增加

4討論

目前普遍認(rèn)為PD是由于中腦黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)神經(jīng)元發(fā)生退行性死亡，并導(dǎo)致紋狀體中DA遞質(zhì)含量減少而發(fā)生的。怎樣防止多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變、損傷從而緩解甚至逆轉(zhuǎn)PD的進(jìn)程，已成為國(guó)內(nèi)外有關(guān)PD治療的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)[6]。MPP+是MPTP的代謝產(chǎn)物，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有較強(qiáng)的選擇性，可以導(dǎo)致人類黑質(zhì)DA能神經(jīng)元產(chǎn)生病理損傷，并出現(xiàn)近似PD的癥狀。故本實(shí)驗(yàn)采用MPP+為誘導(dǎo)劑，以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞)為模型載體。制備擬PD細(xì)胞模型，該模型是國(guó)內(nèi)外常用且經(jīng)典的PD體外模型[7]。

何首烏是蓼科植物何首烏的干燥塊根。塊根作為其主要的藥用部分含有蒽醌、黃酮、二苯乙烯苷、脂肪酸、卵磷脂和一些微量元素等[8]。現(xiàn)代中藥藥理研究發(fā)現(xiàn)，何首烏的重要有效成分：二苯乙烯苷對(duì)神經(jīng)退行性疾病主要是通過抗氧化途徑,清除體內(nèi)自由基而發(fā)揮保護(hù)作用[9],進(jìn)而可以減輕β-amyloid protein誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,改善AD、PD等神經(jīng)退行性疾病的癥狀[10]。何首烏乙醇提取物及二苯乙烯苷對(duì)百草枯和代森錳聯(lián)合誘導(dǎo)的PD小鼠模型、多巴胺能神經(jīng)元和PC12細(xì)胞凋亡具有神經(jīng)保護(hù)作用[11-13]。而EPM對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的PD模型尚未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)EPM對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，可能是通過抗氧化應(yīng)激來修復(fù)損傷的線粒體產(chǎn)生保護(hù)作用。細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞胞體變小、軸突消失且出現(xiàn)小斑點(diǎn)，Hoechst33258染色后細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮和大量的凋亡小體，表明MPP+能明顯誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，MTT法結(jié)果顯示0.5 mmol/L的MPP+作用48 h細(xì)胞存活率下降至對(duì)照組的44.7%； ROS和MDA水平分別是對(duì)照組的25.6倍和2.2倍；LDH泄漏率是對(duì)照組的1.8倍。EPM低、中、高劑量組能劑量依賴地提高細(xì)胞的存活率和降低細(xì)胞內(nèi)MDA和LDH泄漏水平。

對(duì)照組模型組525100ρ(EPM)/(mg?L-1)ROS綠色熒光強(qiáng)度302520151050****

A.對(duì)照組； B.模型組； C.低劑量組； D.中劑量組； E.高劑量組。

與對(duì)照組、模型組比較：*P<0.01。

圖6EPM對(duì)MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中ROS的影響

紅色/綠色熒光比1086420對(duì)照組模型組525100ρ(EPM)/(mg?L-1)****

A.對(duì)照組； B.模型組； C.低劑量組； D.中劑量組； E.高劑量組。

與對(duì)照組、模型組比較：*P<0.01。

圖7EPM對(duì)MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的影響

在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體功能失調(diào)，膜通透性增加，膜電位降低是細(xì)胞早期凋亡的一個(gè)標(biāo)志[14]，而細(xì)胞凋亡也有可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)ROS急劇增加，導(dǎo)致線粒體膜電位改變、線粒體DNA及電子傳遞鏈損傷進(jìn)而破壞線粒體功能，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡[15]。當(dāng)MPP+在線粒體中累積，濃度不斷增高，抑制線粒體復(fù)合體I活性，導(dǎo)致ROS生成增加，當(dāng)ROS在細(xì)胞內(nèi)氧化水平超過了抗氧化作用時(shí)，氧化應(yīng)激就會(huì)發(fā)生，其在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)EPM低、中、高劑量組能夠顯著清除MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平。過多的ROS可以通過多種途徑損傷線粒體，造成線粒體膜電位下降。線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要場(chǎng)所，線粒體復(fù)合體I活性降低使得線粒體呼吸鏈遭到破壞，導(dǎo)致ATP產(chǎn)生減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞因能量耗竭而死亡，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EPM低、中、高劑量組能劑量依賴地升高線粒體膜電位，修復(fù)線粒體功能。

以上結(jié)果提示，EPM對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y損傷的細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性。其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激、改善線粒體功能有關(guān)。EPM中含有29.5%的二苯乙烯苷，而其具有抗氧化和清除自由基等作用，所以二苯乙烯苷可能是其神經(jīng)保護(hù)的主要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。c-Jun 氨基末端激酶(c-JunN-terminal Kinase,JNK)和Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，下一步將探討EPM對(duì)凋亡信號(hào)通路的影響。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Protective effect of extract ofPolygonummultiflorumon SH-SY5Y cells injured by MPP+

YANG Xu1,ZHAO Haizhou2,XU Dade2,LUO Zhanyuan1,ZHU Jing1,LIU Wenhua2,BEI Weijian1

(1.InstituteofChineseMedicinalSciences,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofLifeScience,ZhaoqingUniversity,Zhaoqing526061,China)

Abstract:Objective To investigate the protective effect of extract of Polygonum multiflorum (EPM) on SH-SY5Y cells injured with MPP+. Methods SH-SY5Y cells were exposed to various doses of EPM for 4 h,and then treated with 0.5 mmol/L MPP+ for 48 h. The cell viability was detected with MTT assay,and cell morphology was observed with microscope and Hoechst 33258 staining. The level of malondialdehyde (MDA) and activity of lactate dehydrogenase (LDH) were measured with UV spectrophotometer. Reactive oxygen species (ROS) and the mitochondrial membrane potential were detected with fluorescence microscope. Results Compared with the control group,the viability of SH-SY5Y cells was decreased to 44.7% and the shrunk cell body and nuclear condensation were also observed in MPP+-treated group. Meantime,the activity of LDH,level of MDA and ROS were significantly increased,but the mitochondrial membrane potential was reduced. However,pretreatment with EPM (5,25 and 100 mg/L) prior to MPP+ administration rescued the cell viability,decreased the levels of LDH,MDA and ROS and restored mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells. Conclusion EPM can protect the SH-SY5Y cells against the damage induced by MPP+,which may be involved in anti-oxidant activity.

Key words:extract of Polygonum multiflorum (EPM); SH-SY5Y cells; MPP+-induced cell injury; neuroprotective effect

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015120101

中圖分類號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1006-8783(2016)01-0071-07

作者簡(jiǎn)介：楊旭(1990—)，2013級(jí)碩士研究生，從事中藥活性成分研究與新藥研發(fā)，Email：398342273@qq.com；通信作者：貝偉劍，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理及新藥研發(fā)，Email: 764384278@qq.com；劉文華，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究，Email: wenhualiu@hotmail.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271124)；廣東省重大專項(xiàng)(2013A022100041)；廣東省教育廳“創(chuàng)新強(qiáng)?！惫こ添?xiàng)目(2014KZDXM075)

收稿日期：2015-12-01

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-22 15:31網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160122.1531.001.html