王金全，陳啟助，黃樹林，薄華本

(廣東藥學院 廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

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黃芪總提取物促進PBMC對肝癌細胞的體外殺傷作用

王金全，陳啟助，黃樹林，薄華本

(廣東藥學院 廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 觀察黃芪總提取物(TAE)與人外周血單個核細胞(PBMC)聯(lián)用對肝癌細胞株BEl-7402的體外殺傷作用。方法 MTT法及流式細胞術分別檢測TAE與PBMC在單獨、聯(lián)合應用情況下對BEL-7402細胞的殺傷活性，Burgi修正公式評價藥物聯(lián)合應用對細胞殺傷效果是否具有協(xié)同作用，ELISA法檢測TAE對PBMC分泌IFN-γ、TNF-α細胞因子的影響。結果 TAE與PBMC聯(lián)用對肝癌細胞BEl-7402具有協(xié)同殺傷作用。TAE預先與PBMC孵育后兩者協(xié)同殺傷作用明顯增強。TAE可以刺激PBMC分泌IFN-γ、TNF-α細胞因子。結論 TAE可以促進PBMC對肝癌細胞的體外殺傷能力，二者聯(lián)用具有協(xié)同殺傷作用，其作用機制可能是TAE刺激PBMC分泌IFN-γ和TNF-α以增強免疫殺傷能力。

關鍵詞:黃芪； PBMC； 協(xié)同作用； 抗腫瘤活性； 免疫細胞治療

原發(fā)性肝癌是我國最為常見的惡性腫瘤之一，其起病隱匿且發(fā)展迅猛，大多數(shù)患者在臨床確診時已到晚期失去手術機會[1]。故藥物治療是其重要的治療手段之一，然而目前臨床應用的化療手段毒副作用大，療效不甚理想，所以尋找新的藥物及治療方法成為當務之急。黃芪(astragalus)是豆科多年生草本植物莢膜黃芪和內(nèi)蒙黃芪的干燥根，黃芪總提物 (total astragalus extract,TAE)是從黃芪中提取的有效部位群。黃芪入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性溫、味甘，具有補氣升陽、益氣固表、利尿托毒斂瘡生肌等功效[2]。現(xiàn)代科學研究發(fā)現(xiàn)，黃芪除具有傳統(tǒng)藥效之外，還具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及抑制腫瘤細胞生長等作用[3]。有研究報道黃芪可以直接殺傷腫瘤細胞，但另有研究顯示黃芪是通過調(diào)節(jié)機體功能來抑制腫瘤細胞[4]。為明確黃芪抗腫瘤作用及相關機制，本文采用TAE與人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)單獨或者聯(lián)合應用，考察二者對肝癌細胞BEL-7402的殺傷活性及影響因素，以期為臨床肝臟惡性腫瘤的治療提供一定的治療思路及方法。

1材料與方法

1.1主要材料、試劑及儀器

黃芪總提取物為本室制備，黃芪水煮沸提取2 h，提取液趁熱過濾，殘余藥渣用相同的方法重新提取1次，合并2次提取液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮藥液成含生藥質量濃度1 g/mL的水煎液，4 ℃儲存?zhèn)溆?。淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制劑技術公司)；1640和DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胰蛋白酶(Amresco)；胎牛血清(Gibco公司)；MTT(Sigma)；人腫瘤壞死因子α(TNF-α)、人干擾素-γ(IFN-γ)檢測試劑盒(ELISA法，上海江萊生物科技有限公司)；CO2孵箱(NAPCO)；iMark酶標儀(Biorad)；流式細胞儀(Coulter Elite)。

1.2腫瘤細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株BEL-7402為本室保存。細胞置于37 ℃，5%(φ)CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，在含有10%(φ)新生胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代。如無特殊說明，實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3淋巴細胞的分離和培養(yǎng)

取健康人外周血，F(xiàn)icoll-Hapaque密度梯度離心法分離健康供血者外周血PBMC,用1640將細胞調(diào)至2×106/mL。移至培養(yǎng)瓶中豎立培養(yǎng)(20 mL/瓶)，再加入10%胎牛血清，20 U/mL的IL-2，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中待用。

1.4單獨及聯(lián)合用藥體外細胞殺傷活性的測定

BEL-7402細胞置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中生長至對數(shù)期，0.25%胰酶消化收集細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，使細胞密度大約在1×104/mL，每孔100 μL接種于96孔板。細胞分為4組：單TAE組，即不同濃度的TAE與靶細胞(TC)BEL-7402共孵育；單PBMC即效應細胞(EC)組，不同效靶比(EC/TC)細胞共孵育；聯(lián)合作用組，不同濃度的TAE+不同效靶比的(EC/TC)細胞共孵育共孵育；BEL-7402對照組。同時設置調(diào)零孔、對照孔，每組設定6復孔，各組細胞加藥后作用48 h，MTT法檢測細胞殺傷率，步驟見文獻[5]。抑制率=[1-(實驗孔A值-效應細胞對照孔A值)/靶細胞對照孔A值]×100 %。

1.5Annexin V/PI雙染檢測單獨及聯(lián)合用藥誘導細胞凋亡

收集BEL-7402細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，6孔板中每孔接種約2×105個細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。換液，按下述分別單獨加入TAE或PBMC以及聯(lián)合用藥。單TAE組：40 mg/mL；單PBMC組，效靶比：20∶1；聯(lián)合作用組，40 mg/mL的TAE+效靶比(20∶1)PBMC共孵育；BEL-7402對照組加入相同體積的溶劑，各組加藥后均孵育48 h。小心吸去上清及懸浮的PBMC，0.25%胰酶消化收集細胞，1 000 r/min，離心5 min，去上清，加入100 μL PBS重懸，用濾網(wǎng)過濾。1 000 r/min，離心5 min，去上清，加入100 μL 1× Binding Buffer重懸細胞，分別加入5 μL 488 annexin V和1 μL PI，室溫孵育15 min，加入400 μL 1× Binding Buffer，用FACSCanto Ⅱ流式細胞儀上機檢測。

1.6TAE預先孵育聯(lián)合給藥對腫瘤細胞的殺傷作用

選取合適濃度的TAE與PBMC預先孵育24 h，再作用于BEL-7402靶細胞48 h，MTT法檢測細胞抑制率。同時用相同濃度的未預先與TAE孵育的PBMC做對照。

1.7TAE對PBMC分泌IFN-γ及TNF-α的影響

選取合適濃度的TAE與PBMC預先孵育24 h，離心，取細胞培養(yǎng)上清，ELISA法檢測IFN-γ及TNF-α含量，具體步驟參照試劑盒說明書，同時用相同濃度的未預先與TAE孵育的PBMC做對照。

1.8統(tǒng)計學處理

2結果

2.1TAE與PBMC單獨及聯(lián)合用藥對腫瘤細胞的殺傷作用

單獨應用TAE或者PBMC都可在體外對人肝癌細胞BEL-7402產(chǎn)生一定的殺傷作用。細胞形態(tài)學檢測顯示，陰性對照組顯示BEL-7402呈梭形，生長正常(圖1A)；TAE處理組部分腫瘤細胞體積縮小，核質濃縮，核膜核仁破碎，形成凋亡小體(圖1B)。PBMC處理組可見小的圓形淋巴細胞散在分布，部分淋巴細胞集中在腫瘤細胞周圍，腫瘤細胞生長受到明顯抑制，出現(xiàn)拉絲融合現(xiàn)象(圖1C)。TAE與PBMC聯(lián)合用藥組腫瘤細胞損傷更為明顯(圖1D)。

為明確TAE與PBMC對BEL-7402細胞的殺傷作用的機制，檢測了上述處理對細胞所致的凋亡情況。結果顯示，TAE或者PBMC都可在體外誘導BEL-7402發(fā)生凋亡，但是兩者聯(lián)合應用后，癌細胞的凋亡率明顯增大。見圖2。

A.對照組； B.TAE處理組(40 mg/mL)； C.PBMC處理組(效靶比:20∶1)； D.TAE(40 mg/mL)與PBMC(效靶比:20∶1)聯(lián)合處理組。

圖1TAE與PBMC單獨及聯(lián)合用藥處理后BEL-7402細胞的形態(tài)學表現(xiàn)(200×)

Figure 1Morphology of BEL-7402 cells after treated by TAE with or without PBMC (200×)

A.對照組； B.TAE處理組(40 mg/mL)； C. PBMC處理組(效靶比:20∶1)； D.TAE(40 mg/mL)與PBMC(效靶比:20∶1)聯(lián)合處理組。

圖2TAE與PBMC單獨及聯(lián)合用藥處理后BEL-7402細胞的凋亡情況

Figure 2Apoptosis of BEL-7402 cells after after treated by TAE with or without PBMC

2.2TAE與PBMC單獨及聯(lián)合用藥協(xié)同作用

結果見表1。MTT檢測結果顯示，不同劑量TAE和各種效靶比的PBMC聯(lián)用后，經(jīng)Burgi修正公式計算的Q值均大于1.15，表明兩者具有較強的協(xié)同作用。從表1中還可以發(fā)現(xiàn)，各組劑量的TAE與PBMC的配比中，隨PBMC濃度的增高，Q值逐漸降低，協(xié)同作用逐漸減弱。

2.3TAE預先孵育聯(lián)合給藥對腫瘤細胞的殺傷作用

分別選取TAE與PBMC的中間劑量進行聯(lián)合給藥，預先將PBMC與不同濃度的TAE孵育24 h。結果顯示，其聯(lián)合作用的最終細胞抑制率顯著高于對應的未預先孵育組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，見表2。說明TAE能明顯促進PBMC對腫瘤細胞的殺傷作用。

表1TAE與PBMC單獨及聯(lián)合用藥對腫瘤細胞的殺傷作用

Table 1Synergistic antitumor effect of TAE with PBMC

劑量/(mg·mL-1)TAEPBMC(EC/TC)抑制率/%協(xié)同作用值(Q)協(xié)同作用程度0513.1±2.3未計算未計算01028.1±3.1未計算未計算02036.8±3.4未計算未計算10014.3±1.9未計算未計算20024.1±3.2未計算未計算40030.6±3.4未計算未計算10546.5±4.21.82++20566.7±4.51.96++40582.6±5.02.08++101061.4±5.21.59++201072.2±4.31.58++401083.3±4.31.66++102071.8±3.21.57++202082.1±4.31.58++402089.2±4.31.59++

表2TAE預先孵育聯(lián)合用藥對腫瘤細胞的殺傷作用

Table 2Synergistic antitumor effect when TAE pretreatment

劑量/(mg·mL-1)PBMC(EC/TC)TAE抑制率/%10(預先孵育TAE)1068.5±4.1*10(未預先孵育TAE)1060.6±5.210(預先孵育TAE)2082.2±6.7*10(未預先孵育TAE)2071.4±5.310(預先孵育TAE)4093.1±5.1**10(未預先孵育TAE)4080.7±6.4

與相同劑量未預先孵育TAE處理組比較：*P<0.05,**P<0.01。

2.4TAE對PBMC分泌IFN-γ及TNF-α的影響

結果見圖3。預先與TAE孵育后，PBMC培養(yǎng)液上清中的IFN-γ與TNF-α的含量明顯上升，且隨TAE的劑量增加而升高，說明TAE可以促進PBMC分泌IFN-γ與TNF-α。

20001600120080040004003002001000未預先孵育TAE預先孵育TAE********102040ρ(TAE)/(mg?L-1)****未預先孵育TAE預先孵育TAEBA102040ρ(TAE)/(mg?L-1)ρ(IFN-γ)/(mg?L-1)ρ(IFN-α)/(mg?L-1)

A.對PBMC分泌IFN-γ的影響; B.對PBMC分泌TNF-α的影響； 與相同劑量未預先孵育TAE處理組比較：**P<0.01。

圖3TAE對PBMC分泌IFN-γ及TNF-α的影響

Figure 3Effect of TAE on the secretion of IFN-γand TNF-αby PBMC

3討論

肝癌是臨床上惡性程度較高的腫瘤之一，常規(guī)單一的手術或者化療很難取得理想效果。近年來，綜合治療逐漸成為積極有效的治療方法，綜合治療一般包括前期的手術治療，術后進行放化療加中藥及生物治療，尤其是中藥和生物治療相配合具有較小的毒副作用得到較好臨床治療效果[7]。近年來黃芪在腫瘤的臨床治療中應用較為廣泛，具有減輕放化療毒副作用、提高療效和患者生活質量的效果[8]。PBMC為外周血中分離出的具有單個核的混合細胞群，其中主要包括淋巴細胞、單核細胞(monocyte)、樹突狀細胞等免疫細胞。PBMC經(jīng)某些因素刺激誘導后，活化的淋巴細胞可分泌一種IFN-γ的具有抗病毒、抗增殖及免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子；另外活化的單核/巨噬細胞可以產(chǎn)生TNF-α，能殺傷和抑制腫瘤細胞，這些即是腫瘤生物免疫治療的基本元理論[9]。然而目前關于黃芪的抗腫瘤機制以及其與免疫細胞相互影響方面研究較少。

本研究結果顯示，黃芪總提取物TAE與PBMC在體外均可以抑制腫瘤細胞生長，然而其強度較弱。兩者單獨應用時，在抑制率達到30%左右時再增加劑量其抑制率上升不明顯。但是，二者聯(lián)用時抑制率顯著上升，統(tǒng)計分析結果表明二者具有較強的協(xié)同殺傷作用。先前有研究報道黃芪的抗腫瘤作用與其調(diào)節(jié)機體的免疫功能密切相關[10]。為進一步觀察TAE對PBMC免疫殺傷功能的影響，本研究將PBMC預先與TAE孵育后再聯(lián)合攻擊腫瘤細胞，結果顯示對腫瘤細胞抑制率顯著高于未預先孵育組，表明TAE可能是通過某種途徑首先刺激活化了PBMC，繼而增強了其殺傷腫瘤細胞的功能。為了明確TAE對PBMC是否具有刺激活化PBMC的作用，檢測了TAE預先與PBMC孵育后細胞培養(yǎng)液上清中IFN-γ與IFN-α兩種細胞因子的含量。結果表明，TAE預先孵育能夠顯著增加PBMC中IFN-γ與TNF-α的分泌量，并且分泌量隨TAE劑量的增加而升高。

綜上所述，TAE可以刺激活化PBMC，二者聯(lián)合應用對于肝臟腫瘤細胞BEL-7402具有協(xié)同殺傷效果，其作用機制可能是TAE刺激PBMC分泌IFN-γ、TNF-α，使PBMC活化而增強對腫瘤細胞的殺傷能力?；诖?，將中藥黃芪與生物免疫治療應用于肝癌的臨床治療，具有廣闊的應用前景。

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(責任編輯：幸建華)

Total astragalus extract enhances the cytotoxicity of PBMC against liver cancer cellsinvitro

WANG Jinquan,CHEN Qizhu,HUANG Shulin,BO Huaben

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBiotechnologyCandidateDrugResearch,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To investigate the synergistic cyctoxic effect of total astragalus extract (TAE) combining with human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) on BEL-7402 cells in vitro. Methods MTT assay and flow cytometry were employed to test the cytotoxicity of TAE with or without PBMC on BEL-7402 cells. The modified Burgi formula was used to analyze the effect of two treatments. ELISA was used to detect the IFN-γ and TNF-α level of PBMC after TAE treatment. Results TAE combining with PBMC produced a synergistic cytotoxic effect on BEL-7402 cells. The synergistic degree was increased when PBMC was pretreated with TAE. TAE induced the secretion of IFN-γ and TNF-α by PBMC. Conclusion TAE enhances the cytotoxicity of PBMC against liver cancer cells. TAE combining with PBMC may produce a synergistic cyctotoxic effect,by which mechanism is related to upregulation of IFN-γ and TNF-α secretion and cytotoxicity of PBMC.

Key words:astragalus; peripheral blood mononuclear cells; synergistic cyctoxic effect; antitumor activity; immune cell therapy

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015102302

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1006-8783(2016)01-0066-05

作者簡介：王金全(1979—)，男，講師，主要從事抗腫瘤藥物研究，Email：solo_wjq@126.com；通信作者：薄華本(1981—)，男，講師，主要從事中藥藥理研究，Email：ben1702@126.com。

基金項目：國家自然科學基金項目(81403317)；廣東省青年創(chuàng)新人才基金項目(2014KQNCX140)

收稿日期：2015-10-23

網(wǎng)絡出版時間：2016-01-12 11:10網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160112.1110.004.html