周大磊，章倩倩，劉紅英，段有發(fā)，王麗京

(1.廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

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穿心蓮內(nèi)酯對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖及神經(jīng)內(nèi)分泌分化的抑制作用

周大磊1，章倩倩1，劉紅英2，段有發(fā)1，王麗京1

(1.廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

摘要:目的 探討穿心蓮內(nèi)酯(Andro)對(duì)前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌細(xì)胞增殖及神經(jīng)內(nèi)分泌分化的影響。方法 Andro處理前列腺癌細(xì)胞(PC3)，用MTT法檢測(cè)48 h時(shí)Andro作用的最大效應(yīng)濃度及對(duì)PC3細(xì)胞增殖的時(shí)間依賴性；進(jìn)一步提取細(xì)胞蛋白，通過Western blotting檢測(cè)神經(jīng)內(nèi)分泌分化標(biāo)志物(NSE、CgA)表達(dá)情況。結(jié)果 Andro作用48 h時(shí)7.5 μmol/L達(dá)到最大效應(yīng)濃度，且隨著時(shí)間的延長Andro抑制PC3細(xì)胞增殖的作用越顯著；Andro能明顯抑制PC3細(xì)胞的增殖，并具有濃度和時(shí)間依賴性。Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，NSE、CgA是PC3細(xì)胞中神經(jīng)內(nèi)分泌的標(biāo)志物，Andro能顯著抑制NSE、CgA的表達(dá)。結(jié)論 Andro可抑制PC3細(xì)胞增殖及神經(jīng)內(nèi)分泌分化。

關(guān)鍵詞:穿心蓮內(nèi)酯； 前列腺癌； 細(xì)胞增殖； 神經(jīng)內(nèi)分泌分化

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，Andro)是天然抗炎植物藥穿心蓮主要有效成分之一，為二環(huán)雙萜內(nèi)酯類化合物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Andro具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、治療糖尿病、降低血壓、抑制血小板聚集及抗血栓形成等作用[1-2]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證明Andro對(duì)口腔癌[3]、胰島素瘤[4]以及黑色素瘤[5]具有明顯的抑制作用，盡管Andro抗腫瘤作用已被證實(shí)，但其對(duì)前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化的作用研究尚無報(bào)道。前列腺癌是男性常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，居全球癌癥發(fā)病率第5位[6]，在美國其發(fā)病率高居男性惡性腫瘤首位[7]。近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國前列腺癌發(fā)病率日趨上升。目前，臨床上治療前列腺癌的主要方法為雄激素去勢(shì)療法。但是，雄激素阻斷療法對(duì)前列腺癌組織內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌分化基本無效[8]，并且預(yù)后差[9]，患者平均生存時(shí)間5～17.5個(gè)月[10]。所以尋找治療前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化的藥物，改善前列腺癌患者生活質(zhì)量具有重要的臨床意義。本文選用人源的具有神經(jīng)內(nèi)分泌特性的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3為體外模型，研究Andro對(duì)前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器Thermo Scientific Series 8000 水套CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾)；AIRTECH超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)；美國BioTek ELx800通用酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；GE ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀(美國通用)；恒溫振蕩金屬浴(賽默飛世爾)；Thermo Scientific MicroCL 17微量離心機(jī)(賽默飛世爾)；Thermo Scientific Heraeus Multifuge X1系列離心機(jī)(賽默飛世爾)。

1.1.2藥物與試劑Andro(西格瑪奧德里奇，純度：98%)；MTT(西格瑪奧德里奇，純度：98%)；二甲基亞砜(上海生工)；DMEM(Gibco)；青霉素/鏈霉素(Gibco)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(1X)(Gibco)；胎牛血清(賽默飛)；Anti-Chromogranin A 抗體(默克密理博)；Human/Mouse Enolase 2/Neuron specific Enolase 抗體(R&D Systems)；GAPDH (14C10) 兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology)。

1.2方法

1.2.1MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖以3×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度將PC3細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，按實(shí)驗(yàn)要求加入終濃度為0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L的Andro，并設(shè)立溶劑DMSO對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)平行孔，于48 h檢測(cè)Andro作用細(xì)胞的最大效應(yīng)濃度。并用Andro作用的最大效應(yīng)濃度處理PC3細(xì)胞，培養(yǎng)0、24、48、72 h，觀察隨著時(shí)間的延長，Andro對(duì)PC3細(xì)胞增殖作用的影響。檢測(cè)時(shí)每孔加入MTT工作液10 μL，37 ℃孵育4 h，去除上清液后加入150 μL的DMSO，置于37 ℃恒溫?fù)u床，10 min后通過酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度值(A490)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)以5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度將PC3細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為2組：DMSO對(duì)照組、7.5 μmol/L Andro給藥組。48 h后，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液50 μL，冰上裂解30 min，然后以4 ℃，13 000×g離心10 min，收集上清液保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

用BCA法精確測(cè)量兩組組蛋白質(zhì)含量后，取等量蛋白質(zhì)加入各電泳通道 (約40 μg)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1 h，TBST(pH=7.6)清洗3次，5 min/次，分別加入Anti-Chromogranin A(CgA)抗體(1∶3 000)、Neuron specific Enolase(NSE)抗體(1∶3 000)(NSE和CgA均為神經(jīng)內(nèi)分泌分化標(biāo)志物)以及內(nèi)參GAPDH(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，再用TBST清洗3次，5 min/次，ECL法顯色。

2結(jié)果

2.1Andro對(duì)PC3細(xì)胞增殖抑制作用的最佳效應(yīng)濃度

采用不同藥物濃度(0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L)Andro處理PC3細(xì)胞，48 h后通過MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Andro抑制PC3細(xì)胞增殖的作用隨著濃度的增加而逐漸降低。并且，在7.5 μmol/L時(shí)達(dá)到最佳效應(yīng)濃度，抑制率達(dá)到21%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明Andro濃度為7.5 μmol/L時(shí)對(duì)PC3細(xì)胞增殖抑制效果最明顯。見圖1。

2.2Andro對(duì)PC3細(xì)胞增殖抑制作用的時(shí)間依賴性

用經(jīng)7.5 μmol/L Andro處理的PC3細(xì)胞做細(xì)胞增殖時(shí)間梯度(0、24、48、72 h)檢測(cè)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，隨著作用時(shí)間的延長Andro對(duì)PC3細(xì)胞增殖抑制作用越明顯，且給藥48、72 h后抑制作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

120110100908070細(xì)胞增殖率/%*******12.51517.5012.557.510c(Andro)/(μmol?L-1)

與DMSO對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖1Andro處理濃度對(duì)PC3細(xì)胞增殖的影響

Figure 1Effect of andrographolide at different concentrations on the proliferation of PC3 cells

****7.5μmol/LAndroDMSO724824022020018016014012010080細(xì)胞增殖率/%t/h

與DMSO對(duì)照組比較：**P<0.01。

圖2Andro處理時(shí)間對(duì)PC3細(xì)胞增殖的影響

Figure 2Effect of andrographolide at different times on the proliferation of PC3 cells

2.3Andro對(duì)PC3細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌分化的抑制作用

結(jié)果見圖3，Andro治療PC3細(xì)胞后，神經(jīng)內(nèi)分泌分化標(biāo)志物NSE和CgA蛋白的表達(dá)均顯著受到抑制；免疫印跡條帶灰度分析也顯示Andro組NSE和CgA蛋白的表達(dá)顯著低于DMSO對(duì)照組(P<0.01)。表明Andro具有抑制PC3細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌分化的作用。

NSECgAGAPDH蛋白相對(duì)表達(dá)量1.21.00.80.60.40.20.0DMSOAndroNSECgA****

與DMSO對(duì)照組比較：**P<0.01。

圖3Andro對(duì)PC3中神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物NSE、CgA相對(duì)表達(dá)量的影響

Figure 3Effect of andrographolide on the expression of neuroendocrine markers NSE and CgA in PC3 cells

3討論

Andro作為傳統(tǒng)中藥穿心蓮主要成分之一，其藥理作用雖被國內(nèi)外學(xué)者廣泛研究，但尚未發(fā)現(xiàn)有抑制前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化作用的報(bào)道。在臨床病理診斷中前列腺癌的神經(jīng)內(nèi)分泌化程度的標(biāo)志物為神經(jīng)元特異性稀醇化酶(NSE)和嗜鉻素A(CgA)。NSE是神經(jīng)源性細(xì)胞分泌的一種蛋白酶，已有研究表明臨床神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者體內(nèi)NSE的水平較正常人明顯增高，遂將其作為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷指標(biāo)之一，CgA是診斷神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的重要標(biāo)志物之一，且已廣泛用于多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，如嗜鉻細(xì)胞瘤[11]、小細(xì)胞性肺癌[12]等的臨床病理診斷。因此，本研究選用NSE和CgA作為評(píng)價(jià)前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌化程度的相關(guān)指標(biāo)。

本研究以具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化特性的人源性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3為研究對(duì)象。文獻(xiàn)報(bào)道，前列腺癌細(xì)胞PC3具有神經(jīng)內(nèi)分泌癌特性[13]。通過MTT篩選實(shí)驗(yàn)得出，Andro對(duì)PC3細(xì)胞增殖抑制的最佳效應(yīng)濃度為7.5 μmol/L，然后以終濃度7.5 μmol/L的Andro處理細(xì)胞，通過MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Andro對(duì)PC3的增殖抑制率，同時(shí)，通過免疫蛋白印跡法檢測(cè)當(dāng)Andro作用濃度為7.5 μmol/L時(shí)，NSE和CgA在PC3細(xì)胞中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Andro明顯地抑制前列腺癌細(xì)胞PC3的增殖，且抑制作用具有濃度與時(shí)間依賴性；同時(shí)，Andro下調(diào)了PC3中神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物NSE、CgA的表達(dá)。表明Andro具有抑制PC3細(xì)胞增殖和神經(jīng)內(nèi)分泌分化的作用，對(duì)具有神經(jīng)內(nèi)分泌化的前列腺癌有潛在的治療作用。但是，Andro抑制PC3細(xì)胞增殖及神經(jīng)內(nèi)分泌分化的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。有文獻(xiàn)報(bào)道，Andro通過抑制NF-κB信號(hào)通路對(duì)胃癌[14]、鼻咽癌[15]、口腔癌[3]、胰島素瘤[4]、黑色素瘤[5]等癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。同時(shí)，有研究表明前列腺癌的神經(jīng)內(nèi)分泌分化作用與NF-κB信號(hào)通路的激活相關(guān)聯(lián)[16-17]。因此，Andro對(duì)前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌化的抑制作用可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。總之，Andro抑制前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌化的研究不僅為前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌的臨床治療提供了新的可能，而且還為神經(jīng)內(nèi)分泌分化類腫瘤的藥物開發(fā)提供了新的方向。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Inhibition of andrographolide on the proliferation and neuroendocrine differentiation of prostate cancer cells

ZHOU Dalei1,ZHANG Qianqian1,LIU Hongying2,DUAN Youfa1,WANG Lijing1

(1.VascularBiologyResearchInstitute,SchoolofBasicSciences,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.TraditionalChineseMedicineHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou510120,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of andrographolide on the proliferation and neuroendocrine differentiation of prostate cancer PC3 cells. Methods After PC3 cells were treated with andrographolide,MTT method was used to detect the biggest effective concentration of andrographolide at 48 h and the time-dependent relationship at this concentration on PC3 cell proliferation. Meantime,western blot was employed to measure the expression of neuroendocrine differentiation markers NSE and CgA in PC3 cells. Results Andrographolide significantly inhibited the proliferation of PC3 cells at the dosage of 7.5 μmol/L in a time-dependent manner. The expression of NSE and CgA were decreased in PC3 cells when treated with andrographolide. Conclusion Andrographolide can inhibit the proliferation and neuroendocrine differentiation of PC3 cells.

Key words:andrographolide; prostate cancer; proliferation; neuroendocrine differentation

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110601

中圖分類號(hào):R285

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1006-8783(2016)01-0107-04

作者簡介：周大磊，男，2013級(jí)碩士研究生，Email：zhoudalei1234567@163.com；通信作者：王麗京(1962—)，女，博士，教授，主要從事腫瘤分子生物學(xué)以及血管生物學(xué)方面的研究，Email：wanglijing62@163.com。

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030302083)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030313582)

收稿日期：2015-11-06

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-12 9:52網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160112.0952.001.html