李國(guó)軍 姜媛媛 王瑩 李鄭武

（哈藥集團(tuán)技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150500）

超濾技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中應(yīng)用

李國(guó)軍 姜媛媛 王瑩 李鄭武

（哈藥集團(tuán)技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150500）

超濾是一種非常實(shí)用的膜分離技術(shù)，在生物工程制藥領(lǐng)域，可有效去除發(fā)酵液中的內(nèi)毒素，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)溶液快速脫鹽、脫醇和濃縮等。本文僅對(duì)超濾技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

超濾 分子量 蛋白質(zhì)純化

超濾（ultrafiltration,UF）是一種常見(jiàn)的膜分離技術(shù),以壓力差為動(dòng)力,通常在給定的壓力下,溶液中的小分子可以通過(guò)一定孔徑的薄膜,截留住大分子,從而實(shí)現(xiàn)了大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)的分離。超濾技術(shù)在水處理、食品工業(yè)、染料工業(yè)、生物工程領(lǐng)域等不同的領(lǐng)域和行業(yè)都取得了廣泛的應(yīng)用,在生物工程領(lǐng)域,根據(jù)選擇的微孔膜的孔徑的不同,超濾技術(shù)常用來(lái)對(duì)分子量35-100kDa的蛋白質(zhì)、核酸等的可溶性生物大分子進(jìn)行純化或者濃縮。本文僅對(duì)超濾技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 最早關(guān)于超濾的報(bào)道

1748年,Schmidt使用棉花膠膜過(guò)濾溶液中的懸浮物質(zhì),取得了較好的效果,由于其過(guò)濾的精度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了使用濾紙過(guò)濾的效果,被認(rèn)為是超濾技術(shù)的最早應(yīng)用。直到1896年,馬丁才制造了世界上第一張真正意義上超濾膜。隨著研究的不斷深入和其他學(xué)科的不斷發(fā)展壯大,超濾技術(shù)九十年代后取得了更廣泛的應(yīng)用。

2 超濾技術(shù)的應(yīng)用

在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中超濾技術(shù)有兩大應(yīng)用,一方面應(yīng)用超濾技術(shù)去除細(xì)胞破裂釋放的大量核酸和內(nèi)毒素等小分子雜質(zhì),另一方面用于蛋白溶液的濃縮,脫鹽,脫醇,分級(jí)純化等。其應(yīng)用特點(diǎn)就是①操作簡(jiǎn)單,方便,可以快速的進(jìn)行下游純化。②去除小分子雜質(zhì),提高了純化樹(shù)脂的利用率,節(jié)約原材料成本。③處理量大,速度快,蛋白回收率高。

2.1 去除內(nèi)毒素

王娟,謝飛,琇陳潭等在應(yīng)用超濾技術(shù)去除重組MUC1-MBP融合蛋白中內(nèi)毒素的研究中使用四種方法去除表達(dá)重組MUC1-M B P融合蛋白大腸桿菌發(fā)酵液中的內(nèi)毒素,單獨(dú)使用C M Sepharose FF離子交換層析、CM聯(lián)合Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析、CM加超濾、CM聯(lián)合C6加超濾四種方法去除內(nèi)毒素,使用鱟試劑法檢測(cè)內(nèi)毒素水平。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),離子交換層析或者離子交換層析聯(lián)合疏水層析均不能有效去除內(nèi)毒素,其中疏水層析幾乎沒(méi)有去除內(nèi)毒素的作用,離子交換層析加上超濾可以有效去除內(nèi)毒素。

肖蘭艷,何穎,劉雪婷在重組大腸桿菌表達(dá)的Bere1純化工藝中去除內(nèi)毒素效果研究實(shí)驗(yàn)中采用采用親和層析法、超濾法和離子交換法聯(lián)合應(yīng)用以及TritonX-114萃取法與親和層析法聯(lián)合應(yīng)用,比較這兩個(gè)方法去除重組蛋白溶液中的內(nèi)毒素效果的優(yōu)劣。結(jié)果兩個(gè)方法對(duì)內(nèi)毒素的去除率均為99.99%,內(nèi)毒素含量均符合中國(guó)藥典規(guī)定,但第一種方法蛋白回收率為42.8%,第二種方法蛋白回收率為26.1%?？梢?jiàn)超濾技術(shù)在去除內(nèi)毒素中發(fā)揮了重要作用,而且能提高蛋白回收率。

2.2 脫鹽、脫醇、濃縮

在蛋白質(zhì)的純化過(guò)程中應(yīng)用超濾技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行脫鹽和濃縮,此方法的特點(diǎn)是適合幾百到幾千升的大量液體處理,操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間,而且蛋白回收率高。周冉,王飛,郝潔等應(yīng)用超濾濃縮技術(shù)分離鹿茸中胰島素樣生長(zhǎng)因子1,摸索出最優(yōu)工藝條件。在此方法下,PES膜IGF-1回收率達(dá)到68.32%,蛋白質(zhì)回收率達(dá)到69.20%；改性PES膜IGF-1回收率達(dá)到57.17%,蛋白質(zhì)回收率達(dá)到87.43%。郭立新,高志剛,齊福林應(yīng)用超濾技術(shù)將丙種球蛋白制品中的沉淀劑-乙醇直接脫去,并最終濃縮成終產(chǎn)品。溫濤,劉玉振,方建華應(yīng)用超濾技術(shù)濃縮人血白蛋白,使用此方法脫醇速度快,截留率大,產(chǎn)量高,純度和醇含量均合格。張雄,李云雁,張凱應(yīng)用超濾技術(shù)對(duì)酸溶性三文魚(yú)皮膠原蛋白進(jìn)行脫鹽,當(dāng)料液初始濃度為1.2%,溫度為30℃,壓力為0.3MPa,超濾7次時(shí),氯離子脫除率可達(dá)到74.4%。

2.3 蛋白分級(jí)分離

在蛋白質(zhì)的分離純化上,超濾技術(shù)雖取得廣泛的應(yīng)用。但也有一定的局限性,兩種產(chǎn)品的分子量小于等于5倍,無(wú)法分離或者分析效果很差。相反分子量差值越大,分離效果越好。樊晶,陳連旺,王巨存等應(yīng)用萃取-超濾兩步法從過(guò)期的人血中提純?nèi)搜t蛋白,經(jīng)15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示確定了血紅蛋白蛋白質(zhì)的亞基組成及分子量,電泳遷移率與對(duì)照品完全一致,分離效果較好。

隨著近些年,全球經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,生物工程產(chǎn)業(yè)也不斷發(fā)展、壯大,對(duì)蛋白質(zhì)分離,純化技術(shù)提出了更高的要求。鑒于超濾技術(shù)的優(yōu)勢(shì),在蛋白質(zhì)純化方面一定能取得更廣泛的應(yīng)用。

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1674-2060（2016）03-0227-01