曹朋楊明陳潔晶薛雯眭維國戴勇

（1.廣州軍區(qū)中國人民解放軍第181醫(yī)院中心實驗室、全軍器官移植與透析中心、廣西代謝性疾病研究重點實驗室 廣西桂林 541002；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣西桂林 541004；3.臨床醫(yī)學(xué)研究中心暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院 廣東深圳 518000）

基因組的空間層次結(jié)構(gòu)與其基因位點對功能影響的探究

曹朋1楊明1陳潔晶1薛雯1眭維國1戴勇2

（1.廣州軍區(qū)中國人民解放軍第181醫(yī)院中心實驗室、全軍器官移植與透析中心、廣西代謝性疾病研究重點實驗室 廣西桂林 541002；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣西桂林 541004；3.臨床醫(yī)學(xué)研究中心暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院 廣東深圳 518000）

人類和一些大型動物編碼遺傳信息的基因組大體是呈現(xiàn)出線性排列的，但是由于我們高等生物的特殊性，往往簡單的染色體的線性結(jié)構(gòu)無法滿足遺傳和生物的高級空間構(gòu)變，那么就需要細胞性不同長度的染色質(zhì)通過彼此的連接和折疊進一步拓寬空間域，富集成更復(fù)雜的空間三維結(jié)構(gòu)，而且轉(zhuǎn)錄控制涉及到基因之間物理連接的建立和元素的監(jiān)控，在這個空間結(jié)構(gòu)體中，它表現(xiàn)的更為穩(wěn)定，更深入的是基因組的結(jié)構(gòu)是一個細胞總體功能的承擔者，了解基因組的三維結(jié)構(gòu)，通過對比其空間結(jié)構(gòu)的差異性，可以探索更加深入的疾病領(lǐng)域，而且目前關(guān)于拓撲關(guān)聯(lián)式的作用也成了基因組中的熱點問題.

遺傳信息 基因組 空間域 拓撲關(guān)聯(lián)式 三維結(jié)構(gòu)

引言

在過去的若干年，人類揭開了許多細胞的奧秘，但是對于細胞核中基因組的了解僅僅停留在研究DNA序列的層面上，隨著近幾年科學(xué)技術(shù)的進步，人們開始探索盤繞細胞核中染色體的層次結(jié)構(gòu)，也就是所謂的三維結(jié)構(gòu)，這對于研究高等生物的遺傳和一些疾病至關(guān)重要，每一種生物都是作用在三維空間結(jié)構(gòu)的，而且染色體的空間結(jié)構(gòu)并不是由一段可測距離的DNA通過簡單修飾和包裝纏繞在細胞核內(nèi)的，它是隨著不同類型的細胞而變化的，在同一個細胞核內(nèi)，基因染色體存在方式也不是固定的，近年來，一些科學(xué)家通過遠程相互作用，使基因與遠處的能夠?qū)υ摶蜻M行調(diào)控的一種存在性物質(zhì)發(fā)生接觸，能夠初步了解基因組的空間三維結(jié)構(gòu)在充當著角色何種，具有什么樣的功能，是能夠改變生物的健康問題的一種有效途徑，2008年，美國美諾公司的德克等人通過3c技術(shù)在染色體折疊中的觀察得到的直接成像的染色體單個細胞會導(dǎo)致兩個中心現(xiàn)象細胞內(nèi)的DNA特征組織被識別，并且基因組形成三維結(jié)構(gòu)位點.

1　基因組的三維空間結(jié)構(gòu)模型

基因組的三維結(jié)構(gòu)［1］細胞核遺傳中的重大發(fā)現(xiàn)，近幾年，美國科學(xué)家把人類基因組分成數(shù)以百個小片段片段并且他們重新自由排列組合，成功描繪出清晰度和分辨率最高的基因組三維圖像.

由于基因組不能夠直觀的進行觀察，最初是將哺乳動物細胞核提取出來，將其浸泡在一定質(zhì)量分數(shù)的甲醛溶液中，使其促使細胞核中的蛋白質(zhì)與DNA相互作用，作用一段時間之后，那么會在三維空間彼此靠近而在基因一條完整鏈上彼此分離的基因通過甲醛緊密粘在一起合。然后添加化學(xué)藥劑（主要是分離作用）將緊緊排列在一起的基因鏈打斷，但保留了完整的甲醛鏈接，之后進行觀察，會發(fā)現(xiàn)許多基因都是成對排列，被分切成一百多萬層碎片并混合在一起，最主要的是這個形狀是完全自由的，可以很容易地拉伸和折疊，并且不在干擾其他部分的調(diào)控，基因形成這個結(jié)構(gòu)之后，便可輕易地進入細胞，發(fā)揮其作用［2］。

2　基因組的不同層次組織在細胞和微分實時動力學(xué)的差異水平及其細胞之間的特性轉(zhuǎn)化。

2.1連接位點保持持久連接

染色體通過一定的途徑整合在細胞核內(nèi)，就會聚集形成染色體區(qū)域，利伯曼-艾登在2012年用全基因組分析證明了染色體區(qū)域的形成，通過這個表明，這個區(qū)域中的基因座位于相同染色體最頻繁的作用區(qū)，即使相隔很遠［3］，甚至超過200MB，從一個染色體區(qū)域到另一個相鄰的染色體區(qū)域，染色體可以往復(fù)循環(huán)并且大量重疊，在2006年，布蘭科在小鼠和人類細胞中發(fā)現(xiàn)染色體的大小和相似度有可能在細胞核內(nèi)進行交互，染色體區(qū)域也并不是隨機在細胞核中定位的，利伯曼-艾登發(fā)現(xiàn)在老鼠和人類細胞中。

2.2拓撲關(guān)聯(lián)域

在2010年通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，染色體區(qū)域［4］包含著比它己本身更要小更多的結(jié)構(gòu)定義上的染色體位點，大小在100kb到幾mb，染色體位點被觀察到在染色體域的邊界，在這里，它們被分成不同的染色體區(qū)，并且顯示出一塊由染色質(zhì)和外殼包含的基因的區(qū)域，被稱為周染色質(zhì)區(qū)域，這個區(qū)域是一個100-200mb富含核糖體蛋白的周染色質(zhì)纖維。

通過高分辨率的HI-c和5c技術(shù)發(fā)現(xiàn)了在人類、小鼠和果蠅基因組中包含一些結(jié)構(gòu)域，通常是較大的，稱為拓撲相關(guān)聯(lián)域，其特點是：有明顯的長度關(guān)聯(lián)位點，位于同一區(qū)域中，但是位于相鄰位點之間的作用并不頻繁，相同長度的拓撲關(guān)聯(lián)域可作為微觀的染色體域，那么就表明，拓撲相關(guān)聯(lián)域可能作用在一種相同的結(jié)構(gòu)上，其他的結(jié)構(gòu)是基于確定的相互作用特點，以3c為基礎(chǔ)的技術(shù)上近一步分析表明觀察到的結(jié)構(gòu)是相同的拓撲組織，而且位于同一個拓撲相關(guān)聯(lián)域內(nèi)的基因是相互協(xié)調(diào)分化在表達的過程中。

具有關(guān)鍵功能作用的基因組調(diào)控位點［5］在染色體域內(nèi)，2012年sexton通過使用一種修改后的全基因組3c法在果蠅身上，分析了拓撲關(guān)聯(lián)域，但是人們它的結(jié)構(gòu)尚未在細菌、酵母菌中所進行描述，同時拓撲關(guān)聯(lián)域的分離似乎是遺傳的一個限定邊界，諾拉等人通過刪除位于邊界區(qū)域的X染色體失活中心，正式的證明了所謂的基因的邊界定義，要求是需要插入一個在拓撲關(guān)聯(lián)域和在2個拓撲關(guān)聯(lián)域分裂中間的一個位點，但是，目前還不清楚什么才是拓撲關(guān)聯(lián)域的邊界，而且這些邊界有著許多的生物學(xué)功能，包括轉(zhuǎn)錄起始位點和結(jié)合位點的CTCF蛋白［6］，CTCF蛋白被稱為11-鋅指蛋白，是CTCF基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，那么通過查找CTCF在這些邊界上的有哪些與之相關(guān)的和相互作用的蛋白很重要。

3　基因三維結(jié)構(gòu)功能

3.1調(diào)控基因，控制遺傳的關(guān)鍵

研究DNA的遺傳序列和表達調(diào)控，并且在基因的突變和缺失等方面著手突破人類一些疾病，但是這些研究僅僅是局限于2D水平上，忽略了基因組的空間結(jié)構(gòu)，研究領(lǐng)域受到阻礙。在不久之前，美國麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子遺傳學(xué)家Job Dekker認為基因組空間結(jié)構(gòu)對基因調(diào)控及其關(guān)鍵，除此調(diào)控，其他一些作用也涉及3D結(jié)構(gòu)。例如細胞分裂時，染色體必須正確地復(fù)制［7］、分離，并且在細胞周期中會改變形狀，但是整個過程有條不紊?；蚪M“在細胞分離后就會完全正確的重新組建。染色體會分成若干折疊區(qū)間，在這個含很少堿基數(shù)的折疊區(qū)間中，基因和調(diào)控元件彼此間關(guān)聯(lián)的頻率要高于與其他染色體區(qū)域中的基因和調(diào)控元件發(fā)生關(guān)聯(lián)的頻率。在折疊區(qū)間中DNA形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)使基因可以與染色體上本來相距很遠的調(diào)控元件接觸［8］，而且在老鼠和人類胚胎干細胞以及人類成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)了這些折疊區(qū)間。這些發(fā)現(xiàn)表明它們是“基因組的基本特征”。此外，刪除后會使得基因調(diào)控變得混亂，導(dǎo)致原來沉默的基因被轉(zhuǎn)錄，而原來應(yīng)該轉(zhuǎn)錄的則沉默了。這些研究發(fā)現(xiàn)都證實，“折疊域結(jié)構(gòu)于對保持基因程序受到嚴密調(diào)控是必不可少的。”

3.2三維結(jié)構(gòu)影響癌癥的發(fā)育并發(fā)出預(yù)警信號

在很大程度上，三維基因組的組織結(jié)構(gòu)中染色體的異位是癌癥基因組學(xué)中一個重要問題，我們分析了被捕鼠前B細胞基因組［9］的高解析度高空間組織圖和使用高通量全基因組測序易位內(nèi)將其映射的目標DNA雙鏈斷裂易位（ DNA雙鏈斷裂），RAG核酸內(nèi)切酶切割的抗原受體基因座是占主導(dǎo)地位的，雙易位對目標DNA雙鏈斷裂的基因組不管位置如何，反射高頻雙鏈斷裂在這些位點以及它們在細胞中的一小部分共定位，我們通過電離輻射使基因組DNA雙鏈斷裂。在這些條件下，易位且被高度富集，順沿含有目標DNA雙鏈斷裂單個染色體和其他染色體和亞染色體域內(nèi)直接相關(guān)的預(yù)先存在的空間接近性的方式。通過結(jié)合在基因系統(tǒng)中的兩個高通量的基因組方法，我們觀看癌癥基因組提供了一個新的視野。

復(fù)發(fā)性染色體易位［10］是許多癌癥的標志，這些易位往往代表著高致病性腫瘤的選擇程度，因此，癌癥基因組檢查的最終結(jié)果是要多步轉(zhuǎn)換的，復(fù)雜的基因組變化通常很難完全解釋，但是具有合理的強度的易位可促進復(fù)發(fā)和特定腫瘤的發(fā)生，大部分易位是由DNA雙鏈斷裂后體現(xiàn)的，因此，機械等因素可能影響易位包括植物體內(nèi)基因庫轉(zhuǎn)作頻率，避開細胞的修復(fù)途徑。

在2010年，李柏和克萊因發(fā)現(xiàn)了DNA雙鍵斷裂易位的主要因素，常見的復(fù)發(fā)性惡性腫瘤涉及編碼的DNA雙鍵斷裂易位，在相應(yīng)的抗原受體上有一個作用位點，在淋巴細胞中，這些DNA雙鍵斷裂會引入一種免疫球蛋白和T細胞受體，它位于重組核內(nèi)，在成熟的B細胞中，組裝的Ig位點可以被下游活化誘導(dǎo)，嘧啶核苷酸脫氫酶的作用之間，Ig重鍵開關(guān)復(fù)合，在淋巴惡性腫瘤復(fù)發(fā)的抗原受體軌跡上發(fā)生易位，既反映高頻 DNA雙鍵斷裂的位點還有強大的增強激活或改變致癌基因的能力。

體細胞拷貝數(shù)變化，基因的增添和缺失［11］都是癌癥基因組發(fā)生紊亂的標志，2009年美國麻省理工學(xué)院的Leonid Mirny的實驗室與Dekker合作發(fā)現(xiàn)了“不規(guī)則球體”，認為是基因組中的一個環(huán)促進了特定體細胞拷貝數(shù)變化的形成。將此圖譜與人類癌癥基因組的3D結(jié)構(gòu)進行對比后，它們發(fā)現(xiàn)，染色體中形成環(huán)形結(jié)構(gòu)末端的基因組區(qū)域很可能就是發(fā)生缺失或復(fù)制的地方。

隨著研究的深入，在對在腫瘤的易感性細胞系中一般相互緊密挨著的兩種細胞：慢性髓細胞性白血病中的Bcr-Abl易位、伯基特氏淋巴瘤中的Myc與免疫球蛋白基因間的易位中，似乎這樣的空間結(jié)構(gòu)促進了這樣的異位，而且這種異位的排列可能是某些癌癥的開始萌芽的標志，所以染色體空間結(jié)構(gòu)的差異可能是我們研究的另一個嶄新需要探索的領(lǐng)域。

除了可以用來更好地了解癌癥，染色體折疊成空間結(jié)構(gòu)還可以預(yù)測癌癥，當正常的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞時，基因會以特定方式改變它們的空間結(jié)構(gòu)，特別是在乳腺癌中，特定的基因“在細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞時戲劇性地改變了它們的位置。

4　研究有關(guān)基因組三維結(jié)構(gòu)的前沿技術(shù)

在目前國際上能夠進行闡明和分析基因組三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)主要有染色質(zhì)構(gòu)象捕獲［12］（3C），還有最近幾年的更進一步的衍生而來的（4C、5C）技術(shù)，但是如果單一進行分析那么只對長距離的染色質(zhì)產(chǎn)生相互作用，對整個基因組不能延續(xù)相互作用，所以也進而綜合了兩種方法的迸發(fā)

4.1染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（3C）

在本世紀出的時候，人們研究染色體結(jié)夠仍停留在用顯微鏡技術(shù)的使用上，可以從中標記DNA序列與此相關(guān)的分子，然后確定標記的位點在細胞核中的位置，但是染色質(zhì)是很小的且很薄的，而傳統(tǒng)的熒光顯微鏡分辨率遠遠大于它的，只能粗略的揭示出兩個基因相互是否靠近，不能準確的判斷是否連接在一起，更何況的是，如果作用力作用及其不明顯，那么顯微鏡的作用也是微乎其微了。

于是產(chǎn)生了染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)，可以把染色體的內(nèi)部排列完全暴露出來，然后通過彼此靠近的兩條染色質(zhì)鏈來捕獲相互作用［13］，進而把雙鏈的DNA溶解成一個鏈的單一分子，運用該技術(shù)首先從交聯(lián)作為第一反應(yīng)過程，用一定濃度的甲醛浸泡細胞，把DNA與一些相互關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)粘合在一起，再用限制性內(nèi)切酶把DNA切斷，得到的是DNA和蛋白質(zhì)相互纏繞一起的“球狀物”，最后要把 游離出來的DNA鏈結(jié)合起來創(chuàng)建一個雜交分子物，再用相應(yīng)的抗體來捕獲相關(guān)的“球狀物”。

4.2高通量染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（hi-c）

Hi-c技術(shù)是測定所有基因組序列相對于另一個在三維空間上是怎么樣被安排的，能夠捕獲全基因組范圍內(nèi)的相互作用，hi-c是一種3c衍生技術(shù)，由于交聯(lián)DNA與生物素linker臨近鏈接，能夠基因片段，進行高通量測序，從讀取對中產(chǎn)生基因組范圍內(nèi)的接觸模型，得到的數(shù)據(jù)中存在明顯的聚合物特征，所以hi-c難度不在于捕獲染色質(zhì)本省而在于數(shù)據(jù)的闡述和分析，運用這個方法發(fā)現(xiàn)了染色質(zhì)并非是緊湊、多節(jié)的一種可見結(jié)構(gòu)，而是一種無節(jié)的緊密壓縮構(gòu)象，有活性和無活性的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域折疊成兩個空間各異的區(qū)室。

4.3HTGTS與Hi-C相互作用的技術(shù)

這種結(jié)合數(shù)據(jù)揭示了基因組組織如何支配染色體重排的幾個相關(guān)但不同的原理。第一個是基于每一個細胞相對于它的鄰近細胞如何組織自己基因組的，盡管基因組以一種絕大部分細胞所共有的模式被組織，單個細胞則包含著小偏差。這后一特點讓一小部分子細胞內(nèi)許多基因生理上接近彼此，即使在大部分細胞中它們也不接近彼此。第二個涉及近似性。如果兩個斷裂染色體鏈在給定細胞核的三維空間內(nèi)存在緊密的近似性，它們更可能彼此連接。第三個是應(yīng)用前兩個到不經(jīng)常斷裂的DNA序列中，這樣的序列往往與相同搭檔序列一起改組，其中搭檔序列是在那些生理上互相接近的子細胞中，即使是許多細胞內(nèi)搭檔序列不接近三維基因組結(jié)構(gòu)作用的新了解為解碼細胞核以怎樣方式被組織影響基因組混亂開辟了新道路，其中基因組混亂發(fā)現(xiàn)于癌癥和以染色體重組為特點的其他疾病中。這項研究也指出了為研究細胞核內(nèi)組織性設(shè)計如何影響基本生物學(xué)過程而聯(lián)合2種高通量基因組測定法Hi-C和HGTGS的威力。這種方法的應(yīng)用將提供觀察許多不同類型癌癥基因組的一個新透鏡。

結(jié)語：基因組的空間三維結(jié)構(gòu)是目前基因組學(xué)中最前沿的一個領(lǐng)域，基因決定著生命體的健康狀態(tài)，如果我們知道了基因組的三維結(jié)構(gòu)，那么通過該結(jié)構(gòu)，就會對染色體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)進行分析判斷，找到治病的基因因素，所以三維結(jié)構(gòu)的誕生對研究核遺傳和一些疾病的控制起到了不可低估的作用，隨著未來新技術(shù)的發(fā)展，我們必將更深入的了解與三維空間結(jié)構(gòu)有關(guān)更多的的新課題。

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Genomic gene locations space hierarchy and its impact on the function of inquiry

human beings and some of the large animals in the genome encodes genetic information generally is presented linear arrangement， but because of the special nature of our higher organisms， often simple linear structure of chromosomes can not meet the advanced spatial structure of genetic and biological variations， then the cell type needed by the length of the chromatin and is connected to each other to further expand the space domain folding rich integrated structure more complex three-dimensional space， and involves monitoring the transcriptional control of genes to establish physical connections between the elements and， in this space structure， and it appears more stable， more in-depth structure of the genome is the bearer of a cell overall function， to understand the three-dimensional structure of the genome， by comparing the differences in the spatial structure can explore the deeper areas of the disease， and the current role of topology correlation of genomics has become a hot issue，

genetic information， genomic， spatial domain， topology relational， three-dimensional structure，

Q3

A

1674-2060（2016）05-0015-03

廣西重點實驗室建設(shè)項目計劃任務(wù)書13-051-3

曹朋（1987—），男，黑龍江人，碩士研究生，單位：廣西師范大學(xué)，研究方向：重大疾病致病機理。

戴勇