李筠

（深圳農(nóng)業(yè)科技促進中心 廣東深圳 518000）

與時俱進的SSR分子標記技術(shù)及其在水稻中的應(yīng)用

李筠

（深圳農(nóng)業(yè)科技促進中心 廣東深圳 518000）

SSR標記又稱為微衛(wèi)星標記，具有共顯性、多態(tài)性高、易檢測等優(yōu)點，是目前被廣泛應(yīng)用的一種分子標記。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，SSR分子標記技術(shù)也日趨成熟完善，有條件的實驗室實現(xiàn)了高通量自動化的技術(shù)流程。SSR分子標記技術(shù)在水稻DNA指紋圖譜的構(gòu)建和品種真實性鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因的定位和圖位克隆以及分子標記輔助選擇育種等方面有著廣泛的應(yīng)用。

SSR分子標記 水稻 DNA指紋圖譜

SSR標記（simple sequence repeat）也稱為微衛(wèi)星標記，是分子標記中的一種，是指以少數(shù)幾個核苷酸（2～4個）為單位的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR分子標記技術(shù)在水稻研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，利用該技術(shù)構(gòu)建的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，為品種真實性鑒定、種質(zhì)資源鑒定，育種材料確權(quán)等提供了強有力的技術(shù)支撐。同時，利用SSR分子標記技術(shù)繪制水稻遺傳圖譜，進而研究水稻具有重要農(nóng)藝性狀的基因，對這些基因進行QTL分析、精細定位和圖位克隆，進行分子標記輔助選擇育種等，為水稻分子設(shè)計育種奠定了堅實的基礎(chǔ)，最終將可實現(xiàn)“想要怎樣的稻米，即可創(chuàng)造怎樣的稻米”的夢想。

1　SSR分子標記的優(yōu)點

目前，分子標記可分為四大類：一是基于DNA-DNA雜交的分子標記，如RFLP標記；二是基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的分子標記，如AFLP標記、CAPS標記等；三是基于PCR的分子標記，包括隨機引物PCR標記（如RAPD標記）和特異引物PCR標記（如SSR標記、STS標記）；四是基于DNA測序的標記，如SNP，Indels，EST標記。與第一、二類分子標記相比，SSR標記具有以下優(yōu)點：（1）在染色體上覆蓋率高，數(shù)量多，且是共顯性標記；（2）在基因座位上存在著豐富的等位基因，即多態(tài)性高。例如，水稻RFLP座位的等位基因數(shù)為2-4個，而SSR標記的等位基因數(shù)為2-25個。從多態(tài)性信息含量（PIC）來衡量，RFLP的PIC值為0.39，而SSR標記的PIC為0.69；（3）實驗重復(fù)性較好，結(jié)果可靠性高；（4）基于PCR技術(shù)上的操作，具有快速、簡便、低成本的特點。與第四類分子標記相比，SSR標記雖然在染色體上的覆蓋率不及SNP標記，但SNP標記的研究畢竟起步晚，在水稻很多方面的應(yīng)用中仍處于研發(fā)階段，且開發(fā)SNP標記的成本目前也相對較高。因此SSR標記是一類比較理想的分子標記，目前正廣泛應(yīng)用于水稻的研究中。

2　SSR分子標記技術(shù)的發(fā)展

2.1SSR分子標記電泳技術(shù)的發(fā)展

SSR分子標記技術(shù)在實驗操作過程中，主要包括4個步驟：樣品制備、DNA提取、PCR擴增和PCR產(chǎn)物檢測。經(jīng)過多年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)非常成熟。以前，PCR產(chǎn)物檢測采用的是聚丙烯酰凝膠電泳技術(shù)，包括變性膠和非變性膠兩種方法。然而，不管采用哪一種方式，都需要經(jīng)過制膠、染色和顯影的步驟，實驗過程相對繁瑣，耗時長，而且未能直觀分析片段大小的精確值，難以區(qū)分差異2bp以下的片段?，F(xiàn)在，PCR產(chǎn)物檢測可以采用毛細管電泳技術(shù)，實驗操作簡便，能精確知道每個材料SSR標記的片段大小值，而且可以實現(xiàn)多重毛細管電泳，例如在人類基因組研究上可以實現(xiàn)24重電泳，在玉米的研究上可以實現(xiàn)10重電泳，而在水稻的研究上可以實現(xiàn)4-5重電泳，大大提高了實驗效率，省時省力且結(jié)果準確可靠。

2.2從人工操作到高通量自動化流程的發(fā)展

實現(xiàn)實驗流程自動化是SSR分子標記技術(shù)發(fā)展的一個重要趨勢。以前實驗過程完全是靠人工來完成，現(xiàn)在各種自動化儀器的引進，在解放勞動力的同時，避免了人為因素造成實驗過程操作的失誤。DNA提取過去采用的是SDS法，CTAB法等，均可提取高質(zhì)量DNA；現(xiàn)在可采用DNA自動化提取技術(shù)，當前比較流行的是磁珠法核酸純化技術(shù)，該方法采用了納米級磁珠微珠，這種磁珠微珠的表面標記了一種官能團，通過同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)來達到提取和純化DNA的目的［1］。PCR擴增過去完全是人工操作，每次實驗需要實驗人員按擴增體系比例配置引物、DNA樣品、酶，ddH2O等，現(xiàn)在可以采用自動移液工作站，可自動實現(xiàn)96通道的快速操作。PCR反應(yīng)也從過去的2個小時減少到30分鐘。目前大型種業(yè)先鋒、孟山都公司已實現(xiàn)自動化，每天處理的用于玉米育種的單個分子標記數(shù)據(jù)達到20萬個，國內(nèi)各省市科研院所，種子管理站也逐漸引進自動化儀器，實現(xiàn)高通量自動化流程。

3　SSR分子標記技術(shù)在水稻研究中的應(yīng)用

3.1水稻DNA指紋圖譜的構(gòu)建和品種真實性鑒定

構(gòu)建DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫可從分子水平上鑒別新品種與已審定品種是否存在差異，從而科學(xué)、快速的判定品種間的特異性、一致性和穩(wěn)定性；也可用于市場上真假品種的鑒定。目前，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所已利用48對SSR標記基本完成對3000多份水稻主推品種的指紋圖譜構(gòu)建；而最早是在2001年，中國水稻所于永紅應(yīng)用篩選出的4對SSR引物，建立了雜交水稻不育系寧2A以及寧2B的DNA指紋圖譜［2］，通過與其他廣泛應(yīng)用的雜交水稻親本材料的遺傳關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)寧2A、2B具有秈稻的遺傳成分，從而在分子水平上解釋了該材料與秈稻親和性較高的原因。而后陸續(xù)有研究單位利用SSR分子標記構(gòu)建水稻品種的DNA指紋圖譜，四川、重慶、安徽、深圳等省市也分別對參加省區(qū)試和歷年推廣的水稻品種構(gòu)建了DNA指紋圖譜［3］。

2007年，農(nóng)業(yè)部頒布了水稻品種真實性鑒定行業(yè)標準“NY/T 1433-2007”，利用12對基礎(chǔ)核心引物和12對擴展核心引物對水稻品種進行鑒定。隨著SSR標記技術(shù)的發(fā)展和DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的日益完善，2014年，農(nóng)業(yè)部重新修訂水稻品種真實性鑒定行業(yè)標準為“NY/T 1433-2014”，從24對SSR標記增加為48對SSR標記，從待測樣品與標準樣品的逐一進行兩兩比較的方法，增加了另一種方法，待測樣品與DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的比較。這樣，SSR標記對種子生產(chǎn)、經(jīng)營、使用、管理等活動已起到重要作用。

3.2遺傳圖譜的構(gòu)建

最先用于水稻遺傳圖譜構(gòu)建的標記是RFLP標記，始于1988年美國康奈爾大學(xué)發(fā)表的連鎖圖，而后在日本RGP網(wǎng)站也公布了連鎖圖，且?guī)缀鯙镃APS標記代替。這兩張連鎖圖是各自獨立構(gòu)建的，所用標記和群體類型不同，因而不能互相參照。隨后，隨著SSR分子標記的廣泛應(yīng)用，美國康奈爾大學(xué)構(gòu)建了水稻微衛(wèi)星標記連鎖圖，圖上的微衛(wèi)星標記達2740多個，而華南農(nóng)業(yè)大學(xué)分子育種重點實驗室利用網(wǎng)上序列資料設(shè)計SSR引物對這些標記稀少的區(qū)域進行了填充和整合，重新構(gòu)建了一幅包括719個SSR標記的圖譜，這個圖譜上SSR標記的分布較均勻，為水稻分子育種的準確性提供了保證。

3.3基因定位和圖位克隆的應(yīng)用

通過遺傳圖譜的構(gòu)建，很多SSR標記在染色體上的位置已經(jīng)確定，因此只要確定基因與分子標記之間的連鎖關(guān)系，就可以確定基因在染色體上的位置。水稻基因定位包括主效基因的定位和微效基因的QTL分析兩方面，前者如控制水稻花粉不育基因S-a，S-b，S-c，S-d，S-e的定位，后者是一些數(shù)量性狀基因的定位。

1986年，劍橋大學(xué)的Coulson等提出圖位克隆的概念，又稱為定位克隆，該方法無須事先知道基因的DNA序列，利用SSR分子標記就可以直接對自然變異的基因進行精細定位，進而進行克隆。水稻方面，各個性狀的基因已有很多被克隆，如水稻粒長粒寬相關(guān)的GS3，GW5，GS5，GW8基因；控制水稻抽穗期的Ghd7，Hd1，Ehd1，Hd3a，OsMADS50，RFT1Hd6，DTH8，DTH2等基因，控制稻米品種的WX，ALK基因等都已被圖位克隆。

3.4分子標記輔助選擇育種（MAS）的應(yīng)用

SSR分子標記最直接的用途是對水稻重要農(nóng)藝性狀進行輔助選擇（marker-aided or assisted selection，MAS），也就是利用目標性狀基因與分子標記之間的緊密連鎖關(guān)系進行間接選擇。結(jié)果十分可靠，且MAS一般可在育種早代時期完成，從而大大縮短育種周期，提高了育種效率［4］。

例如水稻產(chǎn)量性狀相關(guān)基因中，與粒寬GW5 緊密連鎖的SSR標記為RM3328和RM513，位于第5染色體短臂間［5］；Xue等找到與每穗粒數(shù)Ghd7緊密連鎖的SSR標記為RM5436和RM2256［6］；與粒寬GS5緊密連鎖的SSR標記為RM593和RM574［7］；與每穗實粒數(shù)相關(guān)的DEP1連鎖的SSR標記為第9染色體上的RM3770和RM7424［8］。利用這些分子標記，能對育種材料進行快速的篩查，為分子設(shè)計育種奠定了堅實的基礎(chǔ)。

4　結(jié)語

經(jīng)過多年的發(fā)展，SSR分子標記技術(shù)在水稻研究中扮演著非常重要的角色，大力的促進水稻研究工作的前行。SSR分子標記技術(shù)也在日益發(fā)展，目前在有條件的大型種業(yè)公司或者經(jīng)費充足的科研院所，該技術(shù)已逐漸實現(xiàn)自動化、高通量的流程，然而它也有弊端，就是這些進口儀器相對昂貴，且試劑耗材成本高，因此我們要加強儀器和試劑耗材方面的技術(shù)攻克，開發(fā)國內(nèi)先進的儀器和高質(zhì)量的試劑，同時對該技術(shù)各個環(huán)節(jié)的條件進行進一步優(yōu)化和完善，減少時間和成本。另一方面，SSR標記的開發(fā)需要知道DNA序列才能設(shè)計引物，應(yīng)該實現(xiàn)各實驗室間已開發(fā)引物的共享，攜手努力，這樣才能更快更好的致力于水稻的研究工作。

［1］曹士亮，曹靖生，王成波，等.玉米SSR分子標記技術(shù)操作流程研究進展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報.2012，28（15）：1-4.

［2］于永紅，李云海，馬榮榮，等.用微衛(wèi)星DNA標記建立2A的指紋圖譜［J］.中國水稻科學(xué).2001，15（3）：215-217.

［3］肖小余，王玉平，張建勇，等.四川省主要雜交稻親本的SSR多態(tài)性分析和指紋圖譜的構(gòu)建與應(yīng)用［J］.中國水稻科學(xué).2006，20（1）：1-7.

［4］Knapp S J. Marker-Assisted Selection as a Strategy for Increasing the Probability of Selection Superior Genotypes［J］. Crop Science.1998，38：1164-1174.

［5］Wan X Y，Weng J F，Zhai H Q，et al.Quantitative Trait Loci （QTL）Analysis For Rice Grain Width and Fine Mapping of an Identified QTL Allele gw-5 in a Recombination Hotspot Region on Chromosome 5［J］.Genetics，2008，179（4）：2239-2252.

［6］Xue W Y， Xing Y Z， Weng X Y，et al.Natural variation in Ghd7 is an important regulator. of heading date and yield potential in rice［J］.Nature Genetics，2008，40（6）：761-767.

［7］Li Y B， Fan C C， Xing Y Z，et al.Natural variation in？GS5？plays an important role in regulating grain size and yield in rice［J］.Nature Genetics，2011，43（12）：1266-1269.

［8］Yan C J， Zhou J H，Yan S，Chen F，et al.Identification and characterization of a major QTL responsible for erect panicle trait in japonica rice （Oryza sativa L.）［J］.Theoretical and Applied Genetics，2007，115（8）：1093-1100.

Q75

A

1674-2060（2016）05-0088-02

李筠（1984—），女，廣東省汕頭市人，助理農(nóng)藝師，定向博士在讀，研究方向：植物分子育種。