陳雯雯, 段文峰, 劉　洋, 趙　琨,

陶珊珊1, 李云霞1, 孫占剛3, 趙　渝1

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;

2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院,上海 200233; 3.上海蔬菜食用菌行業(yè)協(xié)會,上海 200030)

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新技術(shù)在食品微生物檢驗檢測中的應(yīng)用

陳雯雯1, 段文峰2, 劉洋2, 趙琨1,

陶珊珊1, 李云霞1, 孫占剛3, 趙渝1

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;

2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院,上海 200233; 3.上海蔬菜食用菌行業(yè)協(xié)會,上海 200030)

摘要:現(xiàn)代社會中,隨著人們對食品要求的增加,食品安全越來越成為人們關(guān)注的焦點,因此尋求、建立快速檢測食品微生物的方法十分必要.簡要介紹了幾種新型的用于快速檢驗檢測食品微生物的技術(shù)及其在實際檢驗檢測中的應(yīng)用.

關(guān)鍵詞:食品微生物; 食品檢測; 代謝學(xué)技術(shù); 分子生物學(xué);質(zhì)譜技術(shù)

隨著人們生活水平的提高和現(xiàn)代食品業(yè)的快速發(fā)展,人們對于食品的要求越來越高,食品安全成為人們關(guān)注的重點.然而無論是傳統(tǒng)的發(fā)酵食品,還是現(xiàn)在的新型發(fā)酵產(chǎn)品,都在一定方面存在著潛在的危害,每年關(guān)于由微生物引起的食品安全問題也層出不窮.2011年,一項關(guān)于食源性疾病的主動監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示,我國平均6.5人中就有1人次罹患食源性疾病[1].因此,建立快速檢測食品微生物的方法在食品安全監(jiān)控技術(shù)研究領(lǐng)域具有舉足輕重的作用.本文作者就目前幾種新型的具有良好發(fā)展空間的食品微生物快速檢測方法及其應(yīng)用進行了介紹.

1生理生化技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

生理生化技術(shù)(也稱代謝學(xué)技術(shù))是利用菌體在代謝過程中產(chǎn)生特異物質(zhì)、分子等變化特性,對菌種進行檢測的方法.主要包括ATP發(fā)光法、微量生化法等.

1.1ATP生物發(fā)光法

ATP存在于所有活體生物中,因此可以通過測定樣品中的ATP濃度檢測食品中的活菌數(shù).ATP發(fā)光法通過發(fā)光光度計檢測熒光素酶在ATP的作用下氧化熒光素所產(chǎn)生的熒光強度來檢測菌量[2].具有簡便、省時、快速等特點,還可以被用于大量食品樣本中菌污染情況檢測以及食品現(xiàn)場快速檢測等.

ATP生物發(fā)光法近幾年來在食品檢測方面主要被用于乳制品中乳酸菌的檢測、啤酒中菌落總數(shù)的檢測、調(diào)味品即脫水蔬菜的細菌的測定等等[3].

1.2微量生化法

微量生化法包含微熱量技法、放射測量法等.前者是利用菌在生長過程中產(chǎn)生的熱量變化來鑒別菌種;后者是將微量的放射性標記物標記菌中生長所需要的碳水化合物,通過測量菌種生長過程中產(chǎn)生的具有放射性的CO2來測定食品中的菌量.此類方法均具有快速性、準確性較高的優(yōu)點[4].

除了這兩種技術(shù)之外,電子阻抗法、接觸酶測定技術(shù)因其所具有的優(yōu)勢在檢測食品細菌方面也得到廣泛應(yīng)用.其中電子阻抗法具有敏感性高、可重復(fù)、反應(yīng)快速等優(yōu)點而在食品微生物快速檢測中應(yīng)用廣泛,目前該方法主要被用于樣品中大腸菌群、乳酸菌、酵母菌等[5]的定量檢測.

2分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

分子生物學(xué)方法早在1996年開始應(yīng)用于食品微生物的檢驗檢測中[6].該方法是在基因水平上對目標微生物進行檢測,尤其是用于難培養(yǎng)或抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生物的鑒定與分型,其中主要包括PCR、核酸分子雜交及基因芯片等技術(shù).

2.1常規(guī)PCR技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用

PCR(polymerase chain reaction),是由美國的Kary Mullis等人建立的一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子技術(shù).在20世紀末就以其靈敏度高、目標特異性強、快速等特點,在微生物檢測中得到大量應(yīng)用.現(xiàn)在此方法已經(jīng)被用于精確地檢測和鑒定乳制品中的乳酸菌、雙歧桿菌以及酒類中的酵母菌、水源中的大腸桿菌和大腸菌群等[7-9].

2.2PCR衍生技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

隨著各種技術(shù)的不斷發(fā)展,PCR技術(shù)開始不斷與新技術(shù)進行結(jié)合,形成一些新的PCR衍生技術(shù),例如:qRT-PCR、PCR-DGGE、Multiplex PCR、LAMP等.

qRT-PCR(實時熒光PCR技術(shù)),最早于2006年被用于食品細菌的檢測[10].與常規(guī)PCR相比,它具有特異性強、自動化程度高、避免污染等特點.qRT-PCR技術(shù)近年來已在多種致病細菌、霉菌、酵母以及乳酸菌等重要食品微生物指標的定性和定量檢測中被廣泛應(yīng)用[11].張弛等采用多色熒光,建立了同步檢測食品中3種致病菌的Taqman多重熒光定量PCR法[12].

PCR-DGGE,是將PCR和變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)相結(jié)合的一項技術(shù).理論上只要選擇的電泳條件足夠精細,有一個堿基差異的DNA片段均可被分開[13].PCR-DGGE技術(shù)具有檢測不可培養(yǎng)類的細菌、高檢測率、高重復(fù)性等優(yōu)點.現(xiàn)在,PCR-DGGE技術(shù)主要被應(yīng)用于發(fā)酵類食品[14]、釀酒等食品的微生物檢測與群落研究[15].

與常規(guī)的PCR相比,Multiplex PCR多被用于食品病原微生物的檢驗檢測.病原性食品菌主要包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌等[16-17],除此之外,該技術(shù)還被用于乳酸菌等食品非致病菌的檢測.

LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù))是2000年新開發(fā)的一種核酸擴增技術(shù),在食品細菌、真菌、寄生蟲等檢測中具有一定的應(yīng)用[18-19].

除此之外,分子雜交技術(shù)在微生物檢測中也有一定應(yīng)用,例如基因雜交技術(shù),主要被用于檢測食品中的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等[20];基因芯片技術(shù),被應(yīng)用于微生物的快速檢測、基因表達、檢測基因突變等方面,為食源性疾病的診斷和防治提供了一定的依據(jù)[21-22].

3免疫學(xué)檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

免疫學(xué)檢測技術(shù)是一類基于抗原—抗體特異性反應(yīng)而形成的檢測方法,主要作用對象為目標微生物的某個特異基因的表達產(chǎn)物.

3.1免疫磁性微球技術(shù)

免疫磁珠(IMB)是近幾年發(fā)展起來的一項新型免疫學(xué)檢測技術(shù).該技術(shù)將固化試劑特有的優(yōu)點與免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性結(jié)合于一體,此外還具有高效、快速、可重復(fù)性好、操作簡單和費用低等優(yōu)點.

目前,免疫磁性微球技術(shù)主要在食品樣品(如肉類、蔬菜、水果、牛奶等)的致病微生物檢測中得到了廣泛應(yīng)用.此外,因其高度的靶標特異性和下游良好的檢測技術(shù),免疫磁珠技術(shù)已在大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌以及耶爾森氏菌等重要食品微生物快速檢驗檢測中得到廣泛應(yīng)用[23-24].

3.2酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)是把抗原、抗體反應(yīng)間的特異性與酶的高效作用有機結(jié)合的一種檢測技術(shù)[25].該技術(shù)可以對待測物進行定性定量測定[26].

ELISA常用方法有間接法、競爭法和雙抗體夾心法.前兩者多適用于臨床診斷,而后者主要被用于測定小分子抗原,在食品安全檢測方面應(yīng)用較多[27].Kumar等通過單克隆抗體雙夾心法將海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測靈敏度提高了千倍[28];以新型碳納米管作為固相吸附材料在沙門氏菌的檢測中也取得較好效果[29];ELISA還可與熒光分析技術(shù)結(jié)合用于乳制品的檢測分析[30]等.

除以上技術(shù)外,免疫檢測的方法還有免疫層析技術(shù)[31-32]、免疫熒光法(IFT)、免疫膠體金技術(shù)[33-35]等.正由于免疫學(xué)檢測技術(shù)的高效性、特異性等特點使得該類技術(shù)在未來的食品微生物檢測中具有良好的發(fā)展空間.

4質(zhì)譜技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

質(zhì)譜技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用最早報道于1994年[36].在后基因組時代,轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等為很多新型技術(shù)的產(chǎn)生提供了一定的技術(shù)支持.其中質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)技術(shù)等在食品微生物的快速檢驗檢測中具有良好的發(fā)展前景.

在食品微生物檢驗方面,現(xiàn)在的質(zhì)譜技術(shù)主要被應(yīng)用于快速檢驗海產(chǎn)品中腐敗菌[37]和革蘭氏陽性致病菌等菌種.Karola B?hme等將樣品分離出的細菌,利用MALDI-TOF質(zhì)譜進行鑒定,建立了含多個標準菌的光譜指紋圖譜的提取峰列表,屬特異性和種特異性的峰質(zhì)量數(shù)可作為生物標記用于快速鑒定細菌[38].質(zhì)譜技術(shù)在發(fā)酵型食品的菌種檢驗中也具有一定的應(yīng)用[39].動物源雙歧桿菌亞種的分類鑒定研究不在少數(shù),分子生物學(xué)的方法常被用于區(qū)分這些亞種,但其不能滿足工業(yè)上快速檢驗的需求,而質(zhì)譜技術(shù)則可以達到工業(yè)需求.

在食品微生物快速檢測中,現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)中的液相色譜分離技術(shù)和電子噴霧三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用(LC-ESI/MS/MS) 是最常使用的[40].運用這些質(zhì)譜技術(shù)可快速地檢測出水果、蔬菜、酒、牛奶和肉類等食品中菌種污染情況[41-42].超高效液相色譜(UPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)等均在食品微生物的檢測中得到了一定的應(yīng)用.

作為新技術(shù),質(zhì)譜技術(shù)目前在食品微生物檢驗方面已具有一定的基礎(chǔ),而該技術(shù)在食品微生物檢測方面的應(yīng)用卻只是初見成效,但該技術(shù)依靠耗時短、操作簡單、花費少等特點一定會在食品微生物檢驗檢測方面得到更大的應(yīng)用空間.

5其他快速檢測技術(shù)

除了以上所介紹的各種生物學(xué)方法外,研究者將這些技術(shù)與其他先進技術(shù)結(jié)合,得到一些特定的分析工具或者分析系統(tǒng),從而達到快速鑒定的目的,如生物傳感器技術(shù)、快速測試片[43]、全自動微生物分析系統(tǒng)等等.

生物傳感器技術(shù)是以生物化學(xué)和傳感技術(shù)為基礎(chǔ),用生物活性物質(zhì)作為分子識別元件,利用電子測量儀進行分析的技術(shù)[44].生物傳感器技術(shù)中對目的DNA的測量時間明顯縮短[45],并且操作簡單、靈敏度高、重復(fù)性好,使其成為了一種具有良好發(fā)展空間的新型的食品微生物測定技術(shù).

全自動微生物分析系統(tǒng)是將傳統(tǒng)的微生物生化反應(yīng)和檢測技術(shù)與現(xiàn)代計算機技術(shù)相結(jié)合的一種生物分析系統(tǒng).可被用于鑒定由原料、產(chǎn)品中分離的微生物,并且不需要微生物純化,就可以直接對樣品中的特殊微生物種類和菌群進行檢測[46].該技術(shù)所具有的操作簡便、鑒定快速、準確可靠、高度自動化等特點[47],適用于各類細菌的檢驗和鑒定,成為快速鑒定食品中微生物的較好方法之一.

6小結(jié)

隨著食品安全問題的頻繁發(fā)生,食品微生物的快速檢測方法在食品安全和食品衛(wèi)生檢驗方面的應(yīng)用越來越廣泛,生理生化技術(shù)、分子學(xué)、免疫學(xué)、質(zhì)譜技術(shù)、生物傳感器技術(shù)及指紋圖譜技術(shù)等將成為食品微生物檢測的強力手段,這些不斷更新、完善的技術(shù),更將以其快速、靈敏、簡便等優(yōu)點在食品微生物檢驗檢測中發(fā)揮其重要的應(yīng)用價值.

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(責任編輯：顧浩然)

The application of new technologies in food microbiologicalinspection and detection

CHEN Wenwen1, DUAN Wenfeng2, LIU Yang2, ZHAO Kun1,TAO Shanshan1, LI Yunxia1, SUN Zhan′gang3, ZHAO Yu1

(1.Delevopment Center of Plant Germplasm Resources,College of life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China;2.Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research,Shanghai 200233,China;3.Shanghai Vegetable and Edible Fungi Industrial Association,Shanghai 200030,China)

Abstract:In today′s society,as people′s demand for food increases,the problem of food safety is getting more and more concerns.Therefore it is very necessary to seek and to establish the rapid method detection of food microorganisms.This paper presents several new technologies for rapid detection of food microorganism and their application in the practical detection.

Key words:food microorganism; food testing; metabonomics technology; molecular biology; mass spectrometry

中圖分類號:Q 939.37

文獻標志碼:A

文章編號:1000-5137(2016)01-0121-06

通信作者:趙渝,中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號,上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,郵編:200234,E-mail:zhaoyu@shnu.edu.cn

基金項目:上海師范大學(xué)食品安全與營養(yǎng)創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(DXL123);國家自然科學(xué)基金(31301486);上海市自然科學(xué)基金(13ZR1439600);上海市教委科研創(chuàng)新重點項目(14ZZ123)

收稿日期:2014-12-13