孟勝男，金玉玲

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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奧卡西平對戊四氮致癲大鼠腦組織內(nèi)MMP-2、MMP-9表達的干預(yù)作用①

孟勝男，金玉玲

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通過戊四氮建立大鼠致癲模型，研究奧卡西平(oxcarbazepine，OXC)對大鼠腦組織內(nèi)MMP-2與MMP-9表達的干預(yù)情況。方法：采用SD雄性大鼠(SPF級)，隨機分為正常組、戊四氮致癲組以及戊四氮致癲加高中低濃度奧卡西平組。正常組給予生理鹽水、戊四氮組給予35mg/kg劑量，戊四氮加奧卡西平組高劑量200mg/kg、中劑量100mg/kg、低劑量組50mg/kg。記錄大鼠行為學情況及大鼠疲勞儀上停留時間，應(yīng)用Real-time PCR方法分析MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達量在各組間含量的差異。結(jié)果：用戊四氮制備的大鼠癲癇模型，MMP-2與MMP-9表達明顯上調(diào)，在奧卡西平灌藥3周起就能夠顯著降低MMP-2與MMP-9表達，并且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。RT-PCR結(jié)果表明正常組的MMP-9與MMP-2的mRNA與蛋白表達水平都處于較低的水平，當注射戊四氮后，MMP-2與MMP-9明顯上調(diào)(P<0.01，P<0.01)，當灌注不同劑量的奧卡西平之后，MMP-9與MMP-2的表達明顯下調(diào)，200mg/kg奧卡西平組已接近正常組水平。結(jié)論：奧卡西平通過對大鼠腦組織內(nèi)MMP-2、MMP-9表達的干預(yù)，對戊四氮致癲大鼠腦組織結(jié)構(gòu)和功能具有保護作用，此保護作用具有劑量相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：奧卡西平；戊四氮致癲大鼠；MMP-2表達；MMP-9表達

癲癇是腦部的一種慢性疾患,是一組由大腦神經(jīng)元高度同步化異常放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的腦部疾病[1]癲癇至今尚無根治的方法，因此癲癇的治療成為國內(nèi)外研究的重點[2]基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是Zn2+和Ca2+依賴性蛋白水解酶。MMPs能催化降解細胞外基質(zhì)所有成分。MMPs家族中MMP-2、MMP-9的作用較為重要，并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中MMP-2、MMP-9高度表達。研究發(fā)現(xiàn)MMP-9通過降解基底膜,破壞血腦屏障(BBB)[3~7]。另外有文獻報道在戊四氮致癲模型大鼠中，大腦組織發(fā)生嚴重損傷，血腦屏障通透性降低，同時發(fā)生炎癥性損傷[8~12]。奧卡西平(OXC是新型抗癲癇藥物，本實驗通過戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)來建立大鼠癲癇模型，同時通過檢測MMP-9與MMP-2的表達情況。發(fā)現(xiàn)正常組MMP-9與MMP-2的表達低，注射戊四氮后MMP-9與MMP-2明顯上調(diào)，而奧卡西平能夠下調(diào)這種表達，間接為癲癇機制的闡明提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物分組

220～250g SD品系大鼠(SPF級，大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，實驗條件為室溫，正常晝夜更替，24h供應(yīng)食水。

1.2主要試劑

MMP-2 (72kD,66kD) 單克隆兔抗體，MMP-9 (92kD,82kD,78kD) 單克隆兔抗體，PCR提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒等。

1.3制備模型、分組給藥方案及行為學觀察

220～250g SD品系大鼠40只，隨機分成5組，每組8只。稱取戊四氮(PTZ)1g,加入生理鹽水100mL,溶解，按照35mg/kg標準分別給戊四氮組以及不同濃度奧卡西平組注射，而正常組只注射等量的生理鹽水。按照 Racine分級，對照組以及不同濃度奧卡西平組達到三級以上癲癇發(fā)作三次，視為戊四氮點燃成功，點燃成功后戊四氮隔日一次相同劑量，用來維持癲癇效應(yīng)。奧卡西平組按照高劑量(200mg/kg)、中劑量組(100mg/kg)、低劑量組(50mg/kg)一日兩次灌胃。時間一共3周。戊四氮組及奧卡西平藥物組無死亡。

Racine 分級法：0 級：無任何反應(yīng)；1 級：胡須抖動，面肌抽動；2 級：點頭、咀嚼或濕狗樣抖動；3 級：一側(cè)前肢抬起，陣攣；4 級：站立伴有雙側(cè)前肢陣攣；5 級：跌倒，全身強直陣攣性發(fā)作，或抽搐致死。

實驗結(jié)束后， 全部大鼠通過斷頭處理， 用鍘刀迅速切取大鼠頭部， 將頭腦放置冰上， 用咬骨鉗撥快速開顱骨， 從中取出全部的腦組織， 以備后續(xù)實驗。

1.4RT-PCR檢測

組織內(nèi)總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ，然后PCR擴增經(jīng)同源比對后確定引物序列，MxPro-Mx3000P軟件分析，對PCR的結(jié)果進行處理。

1.5統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1奧卡西平對大鼠行為學變化的影響

實驗中我們觀察到戊四氮組大鼠有明顯的癲癇發(fā)作，表現(xiàn)出前肢震顫等行為學障礙，在大鼠疲勞儀(Rota-Rod)上的停留時間顯著減少(圖1,A，***表示P<0.01)，給予50mg/kg奧卡西平即能夠得到一定的改善，隨著奧氮平給藥劑量的增加，停留時間逐漸增加(#、##、###均表示與戊四氮組的比較)，當奧卡西平達到200mg/kg時，大鼠在疲勞儀上的停留時間與正常對照組一樣(N.S.表示無統(tǒng)計學意義)，說明奧卡西平就能夠顯著改善行為學障礙，大幅度的減少癲癇的發(fā)作次數(shù)和每次發(fā)作的持續(xù)時間。并且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。各組大鼠體重(圖2)沒有明顯的變化,說明奧卡西平不會影響體重，副作用較小，具有使用價值。

圖1　大鼠疲勞儀(Rota-Rod)上的停留時間

圖2　大鼠體重變化

圖3　不同組大鼠組織中MMP-2,MMP-9的mRNA水平表達

2.2RT-PCR結(jié)果

發(fā)現(xiàn)正常對照組MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平的表達量很低，戊四氮作用組顯著升高(P<0.01，P<0.01)，應(yīng)用奧卡西平治療后降低，接近正常對照組水平(圖3)。

3討論

MMP-2與MMP-9主要分布于人體的神經(jīng)組織中，參與了神經(jīng)元的黏附與識別、軸突、樹突的分支與生長以及形成神經(jīng)元環(huán)路的過程，它們在腦損傷后的突觸重建和軸突再生過程中發(fā)揮了重要作用。同時近年來有許多研宄表明基質(zhì)金屬蛋白酶家族參與癲癇的發(fā)生，在發(fā)生癲癇時，體內(nèi)會過度上調(diào)MMP-2與MMP-9的表達，可能就會導致異常的神經(jīng)元的形成，繼而此異常神經(jīng)元發(fā)生異常放電。有研究表明，發(fā)育中的大腦拮抗癲癇發(fā)作所致的突觸重建，發(fā)育中大腦有一種自我保護機制[13，14]奧卡西平(OXC)是新型抗癲癇藥物，它的機制可能是下調(diào)MMP-9與MMP-2的表達，從而導致星形膠質(zhì)細胞的活化被抑制，神經(jīng)元細胞的壞死以及重建異位突觸，從而減輕大腦損傷，由PTZ慢性致癲癇造成的。而MMP-9與MMP-2具體關(guān)系有待進一步研究。這種神經(jīng)保護作用奧卡西平在一定程度與劑量具有線性相關(guān)性，大劑量使用OXC可能會影響幼鼠生長。因此，我們需要更加準確的尋找最佳的安全劑量。在臨床上應(yīng)該積極尋找最佳劑量。RT-PCR結(jié)果表明正常組的MMP-9與MMP-2的mRNA與蛋白表達水平都處于較低的水平，當注射戊四氮后，MMP-2與MMP-9明顯上調(diào)(P<0.01，P<0.01)，當灌注不同劑量的奧卡西平之后，MMP-9與MMP-2的表達明顯下調(diào)，200mg/kg奧卡西平組已接近正常組水平。奧卡西平通過對腦組織內(nèi)MMP-2、MMP-9表達的干預(yù)改善戊四氮致癲大鼠腦的結(jié)構(gòu)和功能，并且具有劑量相關(guān)性。

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The effects of oxcarbazapin on expressions of MMP-2,MMP-9 in chronic epilepsy rats induced by pentylenetetrazole

MENGSheng-nan,JINYu-ling

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Abstract:Objective: To Study MMP-2 and MMP-9 expression in the brain tissue by establishing epileptic rat model using oxcarbazepine (oxcarbazepine, OXC).Methods: The subjects with SD male rats (SPF grade) were randomly divided into normal group, pentylenetetrazol pentylenetetrazol epileptic group and low concentration oxcarbazepine group. Normal saline group were given pentylenetetrazole 35mg/kg dose level. Pentylenetetrazole group were given pentylenetetrazole 35mg/kg dose level, and concentration oxcarbazepine group were given oxcarbazepine the dose of 200mg / kg, the dose of 100mg / kg, the low-dose group 50mg / kg. The residence time on the case and the fatigue behavior of rats instrument rats were recorded. MMP-2, MMP-9 mRNA and protein expression differences in content between the groups were analyzed by real-time PCR .Results:Epileptic rat model was established by using oxcarbazepine (oxcarbazepine, OXC). MMP-2 and MMP-9 expression were significantly upregulated in three weeks. Body weight and food intake of rats in each group did not change significantly. MMP-2, MMP-9 express after the application of oxcarbazepine treatment were reduced to near normal levels in the control group. The brain structure has been basically removed. RT-PCR results showed that in normal group, MMP-9 mRNA and protein expression levels of MMP-2 were at a low level. MMP-2 and MMP-9 were significantly increased (P < 0.01, P <0.01). With the injection pentylenetetrazol, MMP-9 and MMP-2 expression were significantly reduced. 200mg /kg oxcarbazepine group was close to normal levels with using different doses of oxcarbazepine.Conclusions: MMP-2, MMP-9 expression in the rat brain have a protective effect to brain structure and function by oxcarbazepine intervention with injecting pentylenetetrazol. This protective effect relate to dose.

Key words:oxcarbazapin;chronic epilepsy rat;MMP-2;MMP-9

(收稿日期：2015-04-18)

中圖分類號：R742.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0064-03

作者簡介：孟勝男(1985~)女，黑龍江哈爾濱人，在讀碩士研究生。通訊作者：金玉玲(1969~)女，黑龍江佳木斯人,碩士，主任醫(yī)師,碩士研究生導師。E-mail:jyl2017@sina.com。