王立豐 王紀坤 安 鋒 謝貴水

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學觀測試驗站，海南儋州571737）

巴西橡膠樹核糖體蛋白HbRPL14基因逆境響應機制

王立豐 王紀坤 安 鋒 謝貴水

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學觀測試驗站，海南儋州571737）

為研究核糖體蛋白在橡膠樹逆境響應中的作用機制，從巴西橡膠樹品種熱研7-33-97葉片中克隆了核糖體HbRPL14基因，并進行HbRPL14蛋白的生物信息學分析及HbRPL14基因的表達分析。結果表明：其編碼蛋白含有特征性核糖體＿L14家族結構域，該基因在橡膠樹膠乳、花和葉片中表達，但在樹皮中不表達。采用熒光定量分析技術證明干旱、機械傷害和白粉菌侵染均顯著上調HbRPL14基因表達，表明核糖體HbRPL14基因受逆境調控，通過提高核糖體蛋白合成水平，參與橡膠樹對干旱、機械傷害和白粉菌侵染的響應。

巴西橡膠樹；干旱；核糖體蛋白；HbRPL14；基因；逆境響應

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）起源于熱帶，在我國種植經(jīng)常面臨干旱［1］、寒害［2］等逆境脅迫，橡膠樹抗旱、抗寒和抗病等抗逆反應與植物內部蛋白含量或者酶活性增加顯著相關［3］。核糖體是細胞內最重要的細胞器之一，在生物體將DNA所包含的基因信息翻譯為蛋白質的過程中，核糖體在mRNA的指導下合成相應的蛋白質。在翻譯過程中，核糖體需要解讀mRNA的密碼子，招募相應的氨酰tRNA，并催化肽鏈的生成［4］。真核生物核糖體的沉降系數(shù)為80S，它們含有2個亞基，沉降系數(shù)分別為60S和40S［4-6］。目前，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［7］，刺參（Apostichopus japonicus）［8］，橡膠樹［9］等多種物種中發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白，但對其在逆境相響應過程中的作用尚不清楚。已有研究證明，核糖體蛋白會與鈣調蛋白［10］、C7orf30［3］以及核糖體蛋白之間互相結合［11］。筆者推測，作為翻譯調控的重要環(huán)節(jié)，核糖體蛋白參與橡膠樹抗逆反應中的蛋白合成。本研究克隆了核糖體RPL14蛋白基因，采用生物信息學技術分析其定位和功能，并在干旱等處理下研究其在橡膠樹抗逆響應中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院實驗場二隊15年生巴西橡膠樹品種熱研7-33-97成齡開割樹為材料，采集葉片、膠乳、花和樹皮用于組織表達分析［12］。以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院實驗場五隊培育的熱研7-33-97芽接苗為材料，選取均勻一致的2蓬葉且頂棚葉片處于穩(wěn)定期的芽接苗進行干旱、機械傷害和白粉菌侵染等處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料RNA提取和cDNA合成 膠乳、葉片等材料總RNA提取根據(jù)Qin等方法［12］，利用DNase I去除RNA中殘留的少量DNA。所提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計測定OD230、OD260和OD280吸收值以檢測純度，同時采用1%甲醛變性膠電泳檢測RNA的完整性。cDNA第Ⅰ鏈合成參照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas試劑盒說明書［13］。

1.2.2 HbRPL14基因的克隆 根據(jù)Genbank上公布人類、擬南芥和蓖麻（Ricinus communis）等核糖體L14蛋白序列，在橡膠樹EST數(shù)據(jù)庫中做tblastn搜索，通過DNAman8.0軟件拼接同源片段，得到巴西橡膠樹核糖體RPL14基因的cDNA序列。采用primer6.0軟件設計基因特異引物RPL14F1（5’-AGAGATGACCTATGGCAATG-3’）和RPL14R1（5’-CTACAACGGAAGGAGAAAGA-3’），以反轉錄的葉片cDNA第Ⅰ鏈為模板，擴增巴西橡膠樹核糖體蛋白HbRPL14基因的cDNA序列。使用2× Taq PCR MasterMix（天根生化）進行PCR擴增，反應體系為：cDNA 2μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，2×PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O至50μL。PCR擴增程序為94℃變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，凝膠回收純化，并克隆到pMD19-T載體上，經(jīng)菌落PCR檢測，送上海立菲生物技術有限公司廣州測序部進行測序驗證。

1.2.3 HbRPL14蛋白的生物信息學分析 采用NCBIORF Finder在線分析工具預測基因的ORF及其編碼的氨基酸序列，通過Expasy的ProtParam在線分析軟件分析巴西橡膠樹核糖體蛋白HbRPL14蛋白中各種氨基酸含量，并預測得到理論分子量和等電點；用NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫和SMART在線分析軟件分析蛋白的結構；用SignalP 4.1 Server在線分析軟件分析信號肽結構；用TMHMM 2.0 Server在線分析軟件分析蛋白跨膜結構域。在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中通過Blastp搜索其他物種的核糖體蛋白HbRPL14同源蛋白并獲取其序列，利用DNAman8.0軟件進行多重序列比對。

1.2.4 HbRPL14基因表達分析 干旱處理采用先將芽接苗澆水至飽和，然后放在光照培養(yǎng)箱進行斷水處理，連續(xù)采集0～10 d葉片為材料［14］；機械傷害處理采用Qin等的方法［12］；白粉菌處理采用筆者的方法［15］。以熒光定量引物HbRLP14F（5’-TTCTGGCTTGTTGGACTC-3’）和HbRLP14R（5’-ATTGGCTGACCTTGCTTAT-3’）擴增，以HbACTIN（基因登錄號：HO004792）HbACTIN F，5’-GATGTGGATATCAGGAAGGA-3’；HbACTIN R，5’-CATACTGCTTGGAGCAAGA-3’為內參基因。使用BioRad公司的CFX-96熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR，反應程序為：95℃預變性30 s；94℃5 s，60℃20 s，72℃20 s擴增45個循環(huán)。擴增結束后進行溶解曲線制作，從50℃逐漸升溫至95℃，升溫速度0.2℃/s，全過程檢測熒光信號。HbRPL14的表達量采用公式Qt=2-Ct（HbACTIN）-Ct（HbRPL14）計算，Ct為每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。倍數(shù)是指處理葉片和同期對照葉片HbRPL14表達量的比值。

1.3 分析方法

采用SPSS軟件（版本號21）進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和Duncan檢驗分析不同處理間基因表達的差異顯著性。采用Origin 2015軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 HbRPL14基因克隆與生物信息學分析

采用PCR擴增技術克隆的HbRPL14基因（基因登錄號KM086720），全長1 054 bp，其5’端長度為237 bp，3’端長度為244 bp，編碼區(qū)長度為573 bp，編碼191氨基酸（圖1）。其推導氨基酸分子量為20.7 kDa，等電點10.51，分子式為C902H1492N278O256S11，為疏水性穩(wěn)定蛋白。其推導氨基酸與葡萄（Vitis vinifera）VvHLP（XP＿010655685.1），蓖麻（Ricinus communis）RcRPL14（XP＿002526273.1），番茄（Solanum lycopersicum）SlHLPXP＿010318617.1）和山杜英（Nicotiana sylvestris）NsHLPXP＿009803545.1）相似性分別為71.2%，75.39%，67.02%和67.54%，是60s核糖體蛋白RPL14家族成員（圖2）。

從圖3可以看出，HbRPL14推導的氨基酸序列不含有信號肽和跨膜結構域，72～191位氨基酸編碼特異的Ribosomal＿L14 superfamily結構域。亞細胞定位分析表明其在線粒體基質空間、線粒體內膜、線粒體內膜間隙和線粒體外膜的幾率分別為0.92、0.60、0.60和0.60，表明HbRPL14定位在線粒體上。

2.2 HbRPL14基因的表達分析

從圖4可以看出，干旱處理橡膠樹芽接苗10 d的葉片中，HbRPL14在第3天有顯著上調的表達趨勢，隨后隨著干旱處理時間的延長，其表達量逐漸下降。由此說明，核糖體蛋白HbRPL14參與橡膠樹干旱響應的關鍵時期為第3天。

從圖5可以看出，HbRPL14在膠乳中的表達量最高，在花和葉片膠乳表達量次之，在樹皮中不表達。說明其主要在膠乳、花和葉片中起作用。

從圖6可以看出，機械傷害處理葉片后，在1～2 h上調HbRPL14的表達，隨后持續(xù)上升，其表達最高峰出現(xiàn)在機械傷害處理后的10～24 h，說明HbRPL14參與橡膠樹對機械傷害的早期反應。白粉菌侵染后不同級別的葉片中HbRPL14的表達顯著上調，尤其在3級和4級葉片中上調分別為6倍左右（圖7）。說明白粉菌侵染會導致核糖體蛋白HbRPL14表達的顯著增加，與干旱和機械傷害的結果一致。

3 結論與討論

本試驗克隆的HbRPL14基因含有核糖體L14蛋白家族特征的結構域，參與橡膠樹對干旱、機械傷害和白粉菌侵染的響應。

鑒于核糖體蛋白在翻譯中的作用，對核糖體蛋白的結構和定位研究十分深入［16-19］。發(fā)現(xiàn)其定位在線粒體中［16］，受磷酸化調控［17］，并獲得了玉米（Zea mays）［20］、衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）［21］和大腸桿菌（Escherichia coli）［22］核糖體蛋白L14的序列［23-24］。本試驗從橡膠樹品種熱研7-33-97葉片中克隆了HbRPL14基因，與葡萄和蓖麻中的核糖體蛋白RPL14相似度達70%以上，含有特征性核糖體＿L14結構域，沒有跨膜結構和信號肽，并具有定位在線粒體的特點，說明HbRPL14是植物核糖體蛋白RPL14家族成員。

近年來，核糖體蛋白L14調控機制研究進展十分迅速，發(fā)現(xiàn)油菜素內酯調控核糖體蛋白在擬南芥懸浮培養(yǎng)細胞的核分裂中起作用［25］。隨后，又發(fā)現(xiàn)核糖體基因參與酵母凋亡的線粒體依賴途徑［26］，核糖體調控機制正逐漸成為研究熱點［27-28］，橡膠樹生長發(fā)育過程中經(jīng)常遇到干旱、寒害和病蟲害侵染等脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，干旱會誘導橡膠樹葉片產(chǎn)生活性氧，進而導致活性氧淬滅酶基因表達和活性增加。干旱處理3～5 d是橡膠樹生理反應的關鍵時期。本試驗中核糖體蛋白HbRPL14基因受干旱上調表達，其在第3天表達豐度最高，說明其同其他活性氧淬滅酶一起參與了橡膠樹抗旱生理反應。隨后，由于干旱的加重，導致其基因表達持續(xù)下降，機械傷害和白粉菌侵染亦會導致葉片中活性氧含量上升。研究顯示橡膠樹核糖體蛋白HbRPL14基因參與抗逆調控機制。

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（責任編輯 張 坤）

Stress Responsive Mechanisms of Ribosomal Protein HbRPL14 Gene in Rubber Tree（Hevea brasiliensis）

Wang Lifeng，Wang Jikun，An Feng，Xie Guishui
（Danzhou Investigation＆Experiment Station of Tropical Crops ofMinistry of Agriculture，Rubber Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou Hainan 571737，China）

In order to study the mechanism of ribosomal protein of rubber tree in stress response，HbRPL14 gene was cloned from leaves of the rubber tree CATAS7-33-97，characteristics of bioinformatics and gene expression were analyzed.Tissue analysis showed that its coding area contained specific Ribosomal＿L14 superfamily domain.The expression was highest in latex，flower and leaf，while not expressed in bark.Q-PCR analysis showed that drought，mechanicalwounding and powderymildew infection up-regulated HbRPL14 expression at significantly levels.These suggested that HbRPL14 was inducted by stress environment，through increase the ribosomal protein synthesis level，play roles in physiological and molecular stress resistance in rubber tree.

Hevea brasiliensis；drought；ribosomal protein；HbRPL14；gene；stress response

S718.46

A

2095-1914（2016）02-0067-05

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.02.011

2015-07-09

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助（CARS-34-GW5）；國家自然科學基金（31270643）資助；海南省自然科學基金（20153135）資助；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所基本科研業(yè)務費專項資助（1630022015013）。

第1作者：王立豐（1975—），男，博士，副研究員。研究方向：橡膠樹逆境生理與分子生物學。Email：lfngwang@yahoo.com。

謝貴水（1967—），男，博士，研究員。研究方向：橡膠樹生態(tài)學。Email：xie23300459@163.com。