氣相色譜－質(zhì)譜法同時(shí)測定肉制品中9種N－亞硝胺的含量

楊金川，楊莎莎，黃家?guī)X

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州貴陽550001）

氣相色譜－質(zhì)譜法同時(shí)測定肉制品中9種N－亞硝胺的含量

楊金川，楊莎莎，黃家?guī)X＊

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州貴陽550001）

為有效保障肉制品的食品安全，建立適用固相萃?。瓪庀嗌V－質(zhì)譜（SPE－GC－MS）同時(shí)測定肉制品中N－二甲基亞硝胺（NDMA）、N－甲基乙基亞硝胺（NMEA）、N－二乙基亞硝胺（NDEA）、N－二丙基亞硝胺（NDPA）、N－二丁基亞硝胺（NDBA）、N－亞硝基哌啶（NPIP）、N－亞硝基吡咯（NPYR）、N－亞硝基嗎啉（NMOR）及N－二苯基亞硝胺（NDPhA）等9種N－亞硝胺的方法，考察樣品不同提取試劑、不同固相萃取小柱、不同色譜條件對分離檢測的影響。結(jié)果表明：樣品經(jīng)過乙腈提取、固相萃取柱凈化，采用GC－SIM－MS檢測，外標(biāo)法定量，在10～400μg／L，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0．995 3以上，檢出限（LODs）低于0．04μg／kg；在添加水平約為2．67μg／kg時(shí)，該方法的平均回收率在82．64%～98．24%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3．55%～5．98%。該方法簡便、快速，具有良好的靈敏度、重復(fù)性，可適用于同時(shí)測定肉制品中9種N－亞硝胺類化合物的含量。

N－亞硝胺；氣質(zhì)聯(lián)用；肉制品

N－亞硝胺類化合物是一種強(qiáng)致癌物，在迄今發(fā)現(xiàn)的亞硝胺類化合物中，有90%的硝胺類物質(zhì)可以誘發(fā)動物器官的癌變腫瘤。N－亞硝胺易溶于有機(jī)溶劑，除少量的N－亞硝胺（如N－二甲基亞硝胺、N－二乙基亞硝胺及某些N－亞硝基氨基酸）可溶于水外，大多數(shù)都不溶于水。在通常情況下，N－亞硝胺類化合物不易水解，在中性和堿性環(huán)境中較穩(wěn)定，但在酸性溶液及紫外線照射下可緩慢分解［1－2］。

食品中天然存在的N－亞硝胺類化合物含量極低，但其前提物質(zhì)亞硝酸鹽（NaNO2）和胺類廣泛存在于自然界中。亞硝酸鹽和硝酸鹽廣泛應(yīng)用于肉制品的生產(chǎn)中，其具有抑制肉毒梭菌產(chǎn)生肉毒毒素的作用，賦予肉制品特有的顏色、風(fēng)味和質(zhì)地，抑制肉制品貯藏過程中的過熱味和腐敗味。但過量的使用NaNO2，會存在安全隱患。亞硝酸鹽能與胺類物質(zhì)在適宜的條件下反應(yīng)產(chǎn)生致癌性的亞硝胺。亞硝胺通過參與體內(nèi)代謝，誘發(fā)有機(jī)體突變，而產(chǎn)生致畸性和致癌性［3］。食物中，亞硝胺的含量很低，但基質(zhì)的成分卻十分復(fù)雜，有時(shí)會干擾亞硝胺的分析檢測，必須預(yù)先去除。目前，亞硝胺的測定主要通過水蒸氣蒸餾－液液萃?。?］、固液萃取提取［5－6］，液相色譜－質(zhì)譜法（HPLC－MS）［78］、氣相－熱能分析儀（GCTEA）［9］、氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）［10］等檢測。由于肉類基質(zhì)的復(fù)雜性和亞硝胺的含量較低等特點(diǎn)，目前對肉制品中N－亞硝胺類化合物的檢測鮮見報(bào)道。為有效保障肉制品的食品安全，建立GC－MS方法，對傳統(tǒng)肉制品N－二甲基亞硝胺（NDMA）、N－甲基乙基亞硝胺（NMEA）、N－二乙基亞硝胺（NDEA）、N－二丙基亞硝胺（NDPA）、N－二丁基亞硝胺（NDBA）、N－亞硝基哌啶（NPIP）、N－亞硝基吡咯（NPYR）、N－亞硝基嗎啉（NMOR）及N－二苯基亞硝胺（NDPhA）9種N－亞硝胺的含量進(jìn)行檢測，為保障肉制品的安全提供保障。

1材料與方法

1．1試驗(yàn)材料

肉制品：貴州4種常見肉制品臘肉、香腸、牛肉干、醬鹵肉（市場隨機(jī)抽取具有代表性的樣品）。

儀器：氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent GC7890／MS5975C，美國安捷倫公司），震蕩混勻器（Multi－Reax，Heieloph公司），超聲儀（SB25－12DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司），冷凍離心機(jī)（Allegra X－22R，美國貝克曼庫爾特公司），數(shù)顯混勻儀（IKA MS3，KA公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI R－210型，瑞士BUCHI公司）。

試劑：乙腈（分析純），二氯甲烷（色譜純），無水硫酸鈉（分析純），9種N－亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 000mg／L（上海安普試劑有限公司）。

1．2樣品處理

稱取15．00g粉碎肉制樣品于50mL具塞離心管中，加入20mL優(yōu)選出的提取劑，渦旋震蕩提取2min，再超聲提取20min，于高速離心機(jī)中（低溫－5℃，5 000r／min）離心10min，取出上清液于100mL梨形瓶中，底物用20mL提取劑重復(fù)提取1次，離心合并上清液，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至10mL左右，待凈化。將上述濃縮液淋洗前處理優(yōu)選出的固相萃取柱，去水收集濾液，在優(yōu)選出的最佳淋洗劑用量下用二氯甲烷分3次清洗旋蒸瓶，并過柱，將收集液與40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用提取劑定容至1．00mL，過0．45μm濾膜后待檢測。

1．3測定及提取條件的考察

程序升溫：進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1μL，載氣流速1．50mL／min，起始溫度40℃為固定條件，分別考察升溫速率為5℃／min、10℃／min和15℃／min對待測9種N－亞硝胺的分離效果。

色譜柱：在載氣為He，純度≥99．999%；氣體流速1．50mL／min，尾吹氣（He）60mL／min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1μL；最佳程序升溫條件下考察非極性柱HP－5MS（30m×0．250mm×0．25μm）和強(qiáng)極性柱HP－INNOWAX（60m×0．250mm× 0．25μm）的分離效果，進(jìn)樣口溫度250℃。

提取劑：樣品中加入適量N－亞硝胺混合標(biāo)樣溶液，以乙腈和二氯甲烷作為提取劑，采用1．2中樣品處理過程，分別考察對9種待測物的提取效果。

固相萃取小柱：樣品中加入適量N－亞硝胺混合標(biāo)樣溶液，采用1．2中的處理過程，比較C18Cartridges柱（C18柱）、Florisil柱（FL柱）和活性碳小柱（活性碳柱）3種固相萃取柱的萃取效果，以每種萃取小柱所萃取9種亞硝胺的回收率來確定最佳萃取小柱。

淋洗劑用量：選用提取效果最佳的提取劑作淋洗劑，樣品中加入適量N－亞硝胺混合標(biāo)樣溶液，采用1．2中的處理方法，同時(shí)選用5mL、8mL、10mL、12mL、15mL和20mL提取劑用量，比較萃取效果。

1．4質(zhì)譜條件

離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度240℃；電子轟擊（EI）離子源，電子能量70eV；采集模式：選擇離子掃描（SIM）模式，掃描質(zhì)量范圍30～450m／z，閾值150，溶劑延遲11min。

1．5標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

以乙腈為溶劑，將質(zhì)量濃度為2 000mg／L的9 種N－亞硝胺類化合物母液，先稀釋成質(zhì)量濃度為20mg／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將其稀釋成質(zhì)量濃度為10μg／L、20μg／L、50μg／L、100μg／L、200μg／L和400μg／L的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在上述色譜條件進(jìn)行測定，以目標(biāo)物定量離子的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到9種N－亞硝胺類化合物在10～400μg／L的線性關(guān)系。

1．6樣品的添加回收

稱取粉碎的臘肉樣品15．00g，于50mL具塞離心管中，加入200μg／L的9種N－亞硝胺類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平約為2．67μg／kg）200μL，按1．2節(jié)的方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平行進(jìn)行5次樣品測定，同時(shí)做空白樣品試驗(yàn)，檢測其本底成分。

1．7肉制樣品的檢測

通過市場監(jiān)管，隨機(jī)抽取具有代表性的4種貴州常見肉制品臘肉、香腸、牛肉干和醬鹵肉，采用1．2的方法處理4種樣品，每個(gè)樣品平行測定3次，檢測9種N－亞硝胺類化合物的含量。

2結(jié)果與分析

2．1色譜分離效果

2．1．1程序升溫 結(jié)果顯示，當(dāng)升溫速率分別為5℃／min和10℃／min時(shí)，各個(gè)目標(biāo)化合物能夠有效分離，而升溫速率為15℃／min時(shí)，MEMA與NDEA色譜峰的分離效果不佳，在考慮時(shí)間成本的情況下，因此選擇升溫速率為10℃／min。當(dāng)柱溫升高到110℃時(shí)，NDMA、NEMA、NDEA和NDPA的色譜峰已出峰。為提高分析速度，再將升溫速率提高至15℃／min，待NDBA、NPIP、NPYR、NMOR色譜峰流出后，進(jìn)一步將升溫速率提高至40℃／min，分析最后一個(gè)目標(biāo)物NDPhA。反復(fù)試驗(yàn)最終確定升溫程序?yàn)槌鯗?0℃，保持3min，以10℃／min升至110℃，以15℃／min升至200℃，再以40℃／min升至240℃，保持10min。在該色譜條件及1．4的質(zhì)譜條件下，9種N－亞硝胺有較好的分離效果（圖1），9種N－亞硝胺的保留時(shí)間、定性和定量離子見表1。

表1 GC－MS測定9種N－亞硝胺類化合物的保留時(shí)間、定性及定量離子Table 1 Retention time，qualitative and quantitative ions of 9N－nitrosamines by GC－MS

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（200μg／L）9種N－亞硝胺混合的總離子流圖譜Fig．1 Total ion current spectrogram of 9N－nitrosamines standard solutions（200μg／L）

2．1．2色譜柱 試驗(yàn)表明，選用HP－5MS時(shí)，色譜峰分離效果不好，NDMA、NEMA、NDEA的色譜峰沒有完全分開；而選用HP－INNOWAX時(shí)，獲得的色譜峰峰形對稱、定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、分離效果好。因此，試驗(yàn)選用HP－INNOWAX作為色譜柱。

2．2提取凈化條件

2．2．1提取劑 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用二氯甲烷作為提取劑，提取肉制品時(shí)會提取出大量的脂肪，而提出的脂肪不容易除去，因此不適宜提取脂肪含量高的樣品；用乙腈作為提取劑時(shí)，可以有效減少肉制品中脂肪的提出 （含水量較高的肉制品可以適量加入NaCl），因此，試驗(yàn)采用乙腈作為提取溶劑。

2．2．2固相萃取柱 由圖2可知，3種小柱均有較好的萃取回收效率，且活性碳小柱萃取回收效果最好，綜合考慮對脂肪和色素的去除，最終選活性炭小柱為固相萃取小柱。

2．2．3淋洗劑的用量 由圖3可知，隨著淋洗劑用量的增加，回收效率也隨之增加，但當(dāng)用量達(dá)15mL后，回收效率增加不明顯，所以確定淋洗劑的最佳用量為15mL。

2．3方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

由表2可知，該試驗(yàn)方法重現(xiàn)性好，線性范圍廣，線性相關(guān)系數(shù)（R2）達(dá)0．995 3以上；靈敏度高，除NDPhA的檢出限（LOD）為0．02μg／kg外，其他幾種N－亞硝胺類化合物的LOD均在0．03～0．04μg／kg。

2．4精密度與回收率

由表3可知，該方法的平均回收率在82．64%～98．24%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在3．55%～5．98%，表明該方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，可用于同時(shí)測定肉制品9種N－亞硝胺類化合物的含量，滿足GB 2762—2012規(guī)定的要求。

圖2 不同固相萃取柱下9種N－亞硝胺的回收率Fig．2 Recovery of 9N－nitrosamines under different solid phase extraction condition

圖3 不同體積下二氯甲烷淋洗的回收率Fig．3 Recovery of mixed N－nitrosamines standard solution under different methylene chlotide volume elution condition

表2 10～400μg／L線性范圍9種N－亞硝胺的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Linear regression equation，correlation coefficient（R2）and detection limit of 9N－nitrosamines with 10～400μg／L

表3 9種N－亞硝胺的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝5）Table 3 Standard addition recovery and relative standard deviation of 9N－nitrosamines

表4 肉制樣品中9種N－亞硝胺的實(shí)際含量（n＝3）Table 4 Actual content of 9N－nitrosamines in meat product samples

2．5樣品的測定

試驗(yàn)表明：1）橫向上看，檢出率最高的是NDPA，在分析的4種肉制品中，均檢出，且含量較高（4．99～7．94μg／kg）；其次是NMOR，除牛肉干外也均有檢出；個(gè)別檢出的化合物還有NDMA、NDBA、NPYR和NDPhA；只有NEMA、NDEA和NPIP在所有肉制品中均檢出。2）縱向上看，除牛肉干外其他3種肉制品中N－亞硝胺類化合物總含量均大于10μg／kg（表4）。根據(jù)我國食品中污染物限量（GB 2762－2012），肉及肉制產(chǎn)品中只有NDMA有限量標(biāo)準(zhǔn)（≤3．0μg／kg）規(guī)定，除臘肉NDMA的檢出量為1．79μg／kg（小于限量標(biāo)準(zhǔn)3．0μg／kg）外，其他樣品NDMA未檢出，均可判定合格。

3結(jié)論

試驗(yàn)建立了氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用快速測定肉制品中9種N－亞硝胺類化合物含量的分析方法。結(jié)果表明，樣品經(jīng)過乙腈提取、固相萃取柱凈化，采用GC－SIM－MS檢測，外標(biāo)法定量，在10～400μg／L，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0．9953以上，檢出限（LODs）低于0．04μg／kg；在添加水平約為2．67μg／kg時(shí)，該方法的平均回收率在82．64%～98．24%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3．55%～5．98%。該方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB／T5009．26－2003）相比，前處理簡單快速，易于操作，重現(xiàn)性好，靈敏度高，適用于肉制品的快速批量分析檢測，可為肉制品質(zhì)量的判定提供參考依據(jù)，在對4種肉制品的檢測中，除牛肉干外，其他肉制品中N－亞硝胺總含量都比較高，均超過10μg／kg，這可能與產(chǎn)品類型及加工方式等有關(guān)。

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（責(zé)任編輯：孫小嵐）

農(nóng)業(yè)信息·農(nóng)業(yè)工程·資源環(huán)境

Agricultural Information and Technology·Agricultural Engineering·Resource and Environment

Determination of Nine N－nitrosamines Content in Meat Products by GC－MS

YANG Jinchuan，YANG Shasha，HUANG Jialing＊

（Guizhou Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Guiyang，Guizhou550001，China）

Nine N－nitrosamines of NDMA，NMEA，NDEA，NDPA，NDBA，NPIP，NPYR，NMOR and NDPhA in meat products were detected simultaneously by the established suitable SPE－GC－MS to study the effect of different extract reagents，solid phase extraction column and chromatographic condition on separation determination of nine N－nitrosamines for effectively safeguarding food safety of meat products．Results：The linear correlation coefficient and detection limit of the samples within 10～400μg／L are above 0．995 3and below 0．04μg／kg after acetonitrile extraction，solid extraction column purification，GC－SIM－MS detection and external standard methods．The average recovery and RSDof the samples are 82．64%～98．24%and 3．55%～5．98%respectively when the adding level is about 2．67μg／kg．The established SPE－GC－MS method with advantages of simplicity，rapidity，good sensitivity and repetition should be used in simultaneous detection of nine N－nitrosamines content in meat products．

N－nitrosamines；GC－MS；meat product

S851．34＋7；O657．63

A

1001－3601（2016）11－0486－0155－04

2016－05－02；2016－11－05修回

貴州省檢測能力擴(kuò)展專項(xiàng)（201401013）

楊金川（1984－），男，工程師，從事食品分析研究。E－mail：yangjinchuan1984＠163．com

＊通訊作者：黃家?guī)X（1982－），男，工程師，從事食品分析研究。E－mail：2225350312＠qq．com