劉 燕，朱吉海，孫 偉，趙 珺

(1.青海大學醫(yī)學院免疫學教研室；2.青海大學附屬醫(yī)院心胸外科)

細胞轉染中單克隆與混克隆干擾基因效率的比較※

劉 燕1，朱吉海2，孫 偉1，趙 珺1

(1.青海大學醫(yī)學院免疫學教研室；2.青海大學附屬醫(yī)院心胸外科)

目的 比較細胞轉染中單克隆與混克隆干擾基因效率。方法 采用胃泌素特異干擾載體轉染人胃癌原代細胞株L25，經G418抗性篩選獲得混克隆和單克隆細胞，應用RT-PCR、Western blot和免疫熒光三種方法對混克隆細胞和單克隆細胞干擾胃泌素基因的效率進行比較。結果 RT-PCR結果顯示混克隆細胞胃泌素mRNA表達水平被明顯抑制。在挑取的10株單克隆細胞中，胃泌素的表達均受到干擾，其效果有差異，其中有2株單克隆細胞pshRNA-1、pshRNA-10胃泌素mRNA表達水平抑制率達到86%，抑制效率與混克隆細胞相同，其他8株單克隆細胞的平均抑制率為31%。Western blot和免疫熒光結果均顯示單克隆細胞pshRNA-1、pshRNA-10與混克隆細胞在胃泌素蛋白水平的干擾效果相同。結論 采用混克隆細胞進行生物學特性鑒定和后續(xù)基因表達水平研究，實驗信息量大、周期短、污染幾率小、可重復性強，是一種省時、簡便、高效的方法。

混克隆細胞 單克隆細胞 干擾效率

分子克隆實驗中，經常需要把外源性的DNA通過載體導入細胞，以便進行基因功能、基因調控等方面的實驗[1-3]。這些研究要求外源基因能夠穩(wěn)定整合到宿主染色體的細胞中，即我們所說的克隆化細胞[4-5]。以往常用的方法是選擇性標記，將攜帶外源基因的載體加上neo抗性基因，用含G418的選擇培養(yǎng)基篩選出有效表達外源基因的單克隆細胞[6-8]。但這種方法由于實驗周期過長、不可控因素過多，往往鑒定不出有效的單克隆。本研究以干擾胃癌原代細胞株L25中胃泌素基因的表達為例，構建了帶有neo抗性的胃泌素干擾載體(pshRNA-gast)，將其轉染入L25細胞中，經G418抗性篩選建立穩(wěn)定整合外源基因的混克隆細胞株和單克隆細胞株，應用RT-PCR、Western blot和免疫熒光法比較干擾胃泌素表達的單克隆與混克隆細胞中靶基因表達水平的差異，以明確是否有必要通過獲得單克隆細胞進行后續(xù)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

胃泌素干擾質粒pshRNA-gast及人胃癌原代細胞株由實驗室自己構建；細胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰酶購自美國Gibco公司；Trizol及LipofectamineTM2000試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒及PCR 10×Mix試劑購自北京Transgen公司；Gastrin抗體購自英國Abcam公司；二抗購自美國Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將細胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(37 ℃，5% CO2)。用0.25%胰酶消化和傳代。細胞常規(guī)培養(yǎng)至40%～60%匯合時轉染。

1.2.2 細胞轉染和篩選

1.2.2.1 細胞轉染

混合待轉染的質粒和脂質體稀釋液，吹打混勻，室溫靜置20 min。把混合液逐滴加入待轉染的細胞培養(yǎng)皿中，邊加邊晃動培養(yǎng)皿，使轉染液均勻分布于培養(yǎng)皿。轉染細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，除去雙無培養(yǎng)液，換正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。

其后傳代到3～4個100 mm細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。

1.2.2.2 混克隆篩選

細胞轉染48 h后，用0.25%胰酶消化，傳代至60 mm培養(yǎng)皿，使每個視野細胞密度在10個左右，加入含G418(400 μg/mL)的選擇性培養(yǎng)液進行篩選，每日觀察細胞形態(tài)，3～5 d換液，22 d左右混克隆形成。經RT-PCR法鑒定混克隆細胞中胃泌素的干擾效果。

1.2.2.3 分離單克隆細胞

用環(huán)套法從混克隆細胞培養(yǎng)皿中挑取10個單克隆細胞，接種至96孔板，用含G418(400 μg/mL)的培養(yǎng)液繼續(xù)篩選培養(yǎng)，待細胞長滿96孔板后，傳至24孔板繼續(xù)擴大培養(yǎng)，4 w后得到足量的細胞。

1.3 RT-PCR鑒定胃泌素mRNA水平的干擾效果

分別收集混克隆細胞和單克隆細胞，提取細胞的RNA，用RT-PCR法檢測細胞胃泌素mRNA的表達水平。具體方法如下：用Trizol試劑提取細胞總RNA，取4 μg RNA，用隨機引物逆轉錄合成第一鏈cDNA。以1 μL cDNA為模板，以25 μL反應體系進行常規(guī)PCR擴增。所用引物：Gastrin上游，5′GAC GAG ATG CAG CGA CTA TGT 3′；下游，5′ GGG TCT GCC ACG AGG TGT 3′，擴增片段221 bp。β-actin上游，5′CGG GAA ATC GT GCG TGA CAT T 3′，下游：5′CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC 3′，擴增片段510 bp。反應條件：95 ℃下5 min 1個循環(huán)；95 ℃下持續(xù)30 s，62 ℃下持續(xù)30 s，72 ℃下持續(xù)30 s，72 ℃下持續(xù)600 s，32個循環(huán)。產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后用凝膠成像儀照相分析。

1.4 蛋白表達水平鑒定結果

1.4.1 Western blot檢測胃泌素的蛋白表達水平

收集單克隆細胞和混克隆細胞蛋白，進行SDS -PAGE電泳(5%濃縮膠，15%分離膠)，濕轉法100 V電壓轉膜75 min，將凝膠中的蛋白質轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉(1 h)。將兔抗人胃泌素抗體(1：800，4 ℃)孵育過夜；羊抗兔二抗(1：2000)室溫孵育1 h，以 Actin為內參照?；瘜W發(fā)光試劑盒顯色。

1.4.2 免疫熒光法檢測胃泌素的蛋白表達水平

接種適當濃度的細胞懸液至圓形玻片培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2，24 h)。4%的多聚甲醛固定細胞(20 min)。將胃泌素多抗( 1：200，4 ℃)過夜孵育。將FITC標記的羊抗兔二抗(1：50 )避光孵育(37 ℃，1 h)。用DAPY(1 μg/mL)襯染細胞核，抗淬滅劑封片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察照相。

2 結果

2.1 成功篩選出混克隆細胞和單克隆細胞

人胃癌原代細胞株轉染了胃泌素基因干擾質粒后，經G418選擇性培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)22 d形成混克隆。在100 mm的培養(yǎng)皿中可見100個左右的單克隆細胞，每個克隆大小約200個細胞(圖1)。為了進一步獲得單克隆細胞，應用環(huán)套法從混克隆細胞中挑取10個單克隆，用G418選擇性培養(yǎng)液繼續(xù)篩選培養(yǎng)30 d，獲得單克隆細胞。

G418篩選22 d后鏡下可見單個分散的細胞克隆，圖示一個視野內的細胞克隆形態(tài)(a、b×100，c×200)

2.2 胃泌素干擾載體顯著抑制混克隆細胞和單克隆細胞中胃泌素mRNA的表達

收集混克隆細胞和挑選的10株單克隆細胞，應用RT-PCR法分別檢測細胞內胃泌素的mRNA表達水平。結果顯示混克隆細胞內胃泌素基因的表達被明顯抑制(圖2A、B)。10株單克隆細胞中，只有兩株單克隆細胞胃泌素基因的表達有較明顯的抑制效果，分別為pshRNA-1和pshRNA-10(圖2C、D)。

A：混克隆細胞內胃泌素mRNA的表達水平；B：混克隆細胞胃泌素PCR擴增電泳條帶的灰度掃描值；C：篩選的10個單克隆細胞內胃泌素mRNA的表達水平；D：單克隆細胞胃泌素PCR擴增電泳條帶的灰度掃描值

2.3 胃泌素干擾載體顯著抑制混克隆細胞和單克隆細胞中胃泌素蛋白的表達

應用Western blot法分別檢測混克隆細胞和單克隆細胞內胃泌素蛋白的表達。結果顯示，在內參照一致的情況下，混克隆細胞胃泌素的蛋白表達明顯減弱(圖3A、B)。而兩株mRNA水平干擾效果較好的單克隆細胞內胃泌素的蛋白表達也被明顯抑制，pshRNA-1細胞的抑制程度與混克隆細胞相當(圖3C、D)。為了進一步驗證Western blot的結果，我們制作了混克隆和單克隆細胞的爬片，應用免疫熒光法檢測兩種細胞中胃泌素的干擾效果。如圖所示(圖3E)，在對照組細胞的胞漿和胞膜可見強綠色熒光的表達(FITC染色)，而混克隆細胞和兩個單克隆細胞內綠色熒光的表達明顯減弱，且減弱程度相當。說明兩種細胞內胃泌素蛋白均被抑制，與Western Bolt的結果一致。

A：混克隆細胞內胃泌素蛋白的表達水平；B：混克隆細胞胃泌素Wb條帶灰度掃描值；C：單克隆細胞內胃泌素蛋白的表達水平；D：單克隆細胞胃泌素Wb條帶灰度掃描值；E：混克隆和單克隆細胞內胃泌素的表達水平

3 討論

目前，獲得穩(wěn)定表達外源基因的細胞克隆大多是通過篩選單克隆細胞方法[9-10]，但是該過程非常耗費時間和精力，至少需要一個月時間建立轉染的混克隆細胞，再用一個月時間從混克隆中分離得到單克隆。由于單克隆沒有混克隆保存的信息量大，在長期保存的過程中丟失信息的幾率也大。而且在單克隆化的過程中存在不確定因素，經常挑選出十幾個單克隆細胞，經過一個多月時間的單克隆篩選，最后只能得到一兩株穩(wěn)定轉染較成功的細胞。如本實驗中，挑取的10個單克隆細胞經鑒定，穩(wěn)定沉默特定基因的細胞只有2株。篩選22 d得到的混克隆細胞與歷經兩個月篩選得到的單克隆細胞對胃泌素基因的干擾效率基本相同。而篩選混克隆與篩選單克隆比較，具有實驗周期短、操作簡單、結果可靠、細胞長期保存較穩(wěn)定等特點，所以對一些細胞遺傳背景要求不高的實驗，我們可以直接用混克隆進行后續(xù)實驗，而沒有必要單克隆化，減少污染機會，實驗結果也不受影響。

有人擔心混克隆細胞對后續(xù)實驗有影響。其實很多實驗不需要真正的單克隆，只要求細胞能夠表達轉染的重組質粒、達到表達或者干擾目的蛋白的目的。即使我們得到的單克隆，在培養(yǎng)數代后由于細胞中整合的載體會脫落下來，干擾效果也會逐漸減退，所以單克隆并不一定能夠穩(wěn)定地表達外源基因。

應用混克隆細胞進行后續(xù)實驗，需要優(yōu)化篩選條件以得到高效表達目的基因的混克隆，包括優(yōu)化抗生素的篩選條件，其中G418篩選的時間和劑量是至關重要的。篩選過程中當大量細胞死亡的同時有極少數的細胞在不斷增殖，此時不要急于挑取克隆，要繼續(xù)用選擇性培養(yǎng)基篩選，此時已形成克隆的細胞還會有個別脫落死亡，因為早期沒有被篩選掉的細胞DNA可能轉染進細胞了，但沒有整合到宿主的染色體上，又或者DNA整合進宿主的染色體了，但整合的位置不穩(wěn)定，這些細胞只要繼續(xù)篩選會陸續(xù)死亡。一般等到細胞不再發(fā)生脫落、克隆長到足夠大、克隆間即將發(fā)生接觸抑制的時候才能獲得真正整合了外源DNA的細胞克隆。

[1]Sambrook J，Russell DW.Molecular cloning 3ed[M].New York：Cold spring harbor laboratory press，2001：611-627.

[2]鄂征.組織培養(yǎng)和分子細胞學技術[M].北京：北京出版社，1994：12.

[3]薛慶善.體外培養(yǎng)的原理和技術[M].北京：科學出版社，2001：2.

[4]D.L.斯佩克特，L.A.萊因萬德，黃培堂，等.細胞實驗指南[M].北京：科學出版社，2003：7.

[5]葉展，李勁松，趙涵芳，等.hVEGF_(165)單克隆工程細胞的篩選和鑒定[J].外科理論與實踐，2006，11(1)：49-52.

[6]BAO Wei，FU Hai-Jing，XIE Qiao-Sheng，et al.HER2 Interacts With CD44 to Up-regulate CXCR4 via Epigenetic Silencing of microRNA-139 in Gastric Cancer Cells[J]，Astroenterology，2011，141：2076-87.

[7]DENG Hua，GUO Rui-Fang，LI Wen-Mei，et al.Matrix metalloproteinase 11 depletion inhibits cell proliferation in gastric cancer cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，326 ：274-81.

[8]YANG Yan-Hong，DENG Hua，LI Wen-Mei，et al.Profiling Tumor Marker in Serum Based on Gene Expression Identification of Matrix Metalloproteinase 11 as a Predictive[J]，Clin Cancer Res，2008，14：74-81.

[9]HE Shun，YANG Shang-bin，XU Ning-zhi，et al.Aurora kinase A induces miR-17-92 cluster through regulation of E2F1 transcription factor[J].Cell.Mol.Life Sci，2010，67：2069-76.

[10]Sebastian Krug，Johannes Huth，Friederike G?ke，et al.Knock-down of Pdcd4 stimulates angiogenesis via up-regulation of angiopoietin-2[J]，Biochim Biophys Acta，2012，1823(4)：789-99.

Comparative study on the efficiency of gene interference between monoclonal and mixed clone cell during cell transfection

LIU Yan1，ZHU Ji-hai2，SUN Wei1，ZHAO Jun1

(1.Department of Immunology，Qinghai University Medical College；2.Department of Cardiothrocic Surgery，the Affiliated hospital of Qinghai University)

Objective To compare the efficiency of gene interference between monoclonal and mixed clone cell during cell transfection.Methods Gastrin specific short/small hairpin RNAs(shRNAs)vector was transfected into L25 cell.RT-PCR，Western blot and immunofluorescence analyses were used for detecting gastrin expression at the mRNA level and protein level in mixed clone and monoclone which obtained by G418 resistence screening.Results The RT-PCR results showed that the most dramatic decrease in gastrin mRNA level was appeared in mixed clone.The gastrin expression level in 10 monoclones were discrepancy.Among the total monoclones，only pshRNA-1 and pshRNA-10 clones showed the significant decrease in gastrin mRNA level，and there interference efficiency was the same as mixed clone.Consistent with this found，Western blot and immunofluorescence analyses showed that in gastrin interference cells，pshRNA-mixed clone，pshRNA-1 and pshRNA-10 monoclones had almost the same gastrin expression efficiency.Conclusion In cell transfection experiments，there are a lot of problems on the selection of monoclones，such as long cycle for screening，the easiness of losing targeted gene in long-term preservation.While，directly using mixed clone for subsequent research give many advantages such as high authenticity of the experiment，being time-saving and less pollution risk，this method is superior to choose monoclones.

Mixed clone cells Monoclonal cells Interference efficiency

※：國家自然科學基金(編號：81550043)；青海省自然科學基金青年項目(編號：2015-ZJ-940Q) 劉燕(1981～)，女，漢族，青海籍，副教授

R730

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.009

2016-09-11