羅妙玲，徐韞健，李倩珺

(1.海珠區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510220；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120)

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·論著·

生殖道白色念珠菌耐吡咯類藥物的基因表達(dá)*1

羅妙玲1，徐韞健2△，李倩珺2

(1.海珠區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510220；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120)

摘要:目的了解生殖道白色念珠菌耐吡咯類藥物基因的表達(dá)情況。方法收集真菌性陰道炎患者分泌物標(biāo)本93份，分離白色念珠菌后用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，裂解法提取白色念珠菌的吡咯類藥物耐藥株和敏感株的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)白色念珠菌多藥耐藥基因CDRl、CDR2、MDRl的表達(dá)情況。結(jié)果共培養(yǎng)出59株白色念珠菌，18株熱帶念珠菌，10株克柔念珠菌，6株光滑念珠菌；白念珠菌中37株對(duì)氟康唑、酮康唑、咪康唑不同程度耐藥，耐藥率分別為16.7%、18.3%、51.7%；白念珠菌耐藥株CDR1基因的2(-△△Ct)為1.46±0.24，敏感株為1.09±0.27，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.22，P=0.001)；CDR2及MDRl基因的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.170，P=0.800)。結(jié)論白色念珠菌耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，可能與CDR1高表達(dá)有關(guān)，CDR2和MDR1表達(dá)與耐藥性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞:生殖道；白色念珠菌；基因表達(dá)；吡咯類藥物

外陰陰道念珠菌病(VVC)是一種由念珠菌引起的陰道黏膜真菌性感染，近年來(lái)發(fā)病率有明顯上升的趨勢(shì)[1]。由于吡咯類藥物，如酮康唑、氟康唑、咪康唑等具有抗菌譜廣、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床治療真菌感染的首選藥物，然而，近年來(lái)吡咯類藥物的大量應(yīng)用導(dǎo)致耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重。念珠菌的耐藥機(jī)制主要有麥角甾醇合成通路中關(guān)鍵靶酶的變化造成膜成分的改變，生物被膜的形成，編碼藥物外排泵的基因表達(dá)增加，細(xì)胞膜對(duì)藥物通透性改變等[2]。其中外排基因CDR1、CDR2、MDR1過(guò)度表達(dá)是產(chǎn)生耐藥的主要原因。因此，本文就門診患者陰道分泌物中分離的白色念珠菌對(duì)吡咯類藥物相關(guān)耐藥基因的表達(dá)進(jìn)行研究，從分子水平了解耐藥機(jī)制，以期為臨床治療提供參考依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料2015年1～2月廣州市海珠區(qū)第一人民醫(yī)院與廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科門診就診的真菌性陰道炎患者93例，年齡20～45歲，均有典型的豆腐渣樣白帶和外陰瘙癢等癥狀，留取陰道分泌物標(biāo)本，直接革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲或孢子。

1.2儀器與試劑Total RNA 提取試劑、PCR 檢測(cè)試劑及DNA 標(biāo)記物均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；金星 TaqMan預(yù)混體系試劑購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；沙氏培養(yǎng)基和真菌藥敏培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)梅里埃生物公司；氟康唑(15 μg)、酮康唑(15 μg)和咪康唑(10 μg)藥敏紙片購(gòu)自丹麥Rosco公司；Vitek-2 Compact細(xì)菌鑒定儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；CFX 96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3引物及探針設(shè)計(jì)參考GenBank設(shè)計(jì)CDR1、CDR2、MDR1和內(nèi)參基因的引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物及探針序列見(jiàn)表1。

表1　　引物及探針序列

1.4方法

1.4.1真菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)將分泌物轉(zhuǎn)接到沙氏瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)72 h，有菌落生長(zhǎng)者涂片做革蘭染色，鏡下觀察為念珠菌者，接種至科馬嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基上，48 h后觀察顏色，判別菌種，無(wú)法鑒定者通過(guò)Vitek-2 Compact細(xì)菌鑒定儀鑒定。對(duì)菌株進(jìn)行紙片擴(kuò)散(K-B)法藥敏試驗(yàn)，置于溫箱37 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈，依據(jù)表2標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏情況。

表2　　吡咯類藥物抑菌環(huán)直徑的判斷標(biāo)準(zhǔn)(mm)

1.4.2總RNA的抽提液氮裂解白色念珠菌的細(xì)胞壁，用氯仿和異丙醇提取總RNA，用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA樣品純度及濃度。

1.4.3逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄體系：PrimeScript RT標(biāo)記混合液2 μL，總RNA(根據(jù)濃度確定加入量，10 μL體系最大使用500 ng)，RNase Free dH2O加至10 μL；反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系：PCR mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase Free dH2O 10 μL，探針0.5 μL，cDNA 1 μL。發(fā)光基團(tuán)為5′-FAM，淬滅基團(tuán)為TAMRA。擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。計(jì)算方法如下：目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct,△△Ct=目的基因的Ct值-內(nèi)參基因的Ct值。

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)及鑒定結(jié)果93例女性的陰道分泌物均培養(yǎng)出念珠菌，其中59株為白色念珠菌，占63.4%，18株為熱帶念珠菌，10株為克柔念珠菌，6株為光滑念珠菌。

2.2吡咯類藥敏試驗(yàn)結(jié)果59株白色念珠菌菌株經(jīng)過(guò)藥敏試驗(yàn)后，其中37株對(duì)咪康唑、酮康唑、氟康唑中一種或以上藥物耐藥，耐藥率分別為51.7%、18.3%、16.7%，37株納入耐藥組。從敏感株中選取10株納入敏感組。

2.3CDR1、CDR2及MDR1的表達(dá)水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到各基因的Ct值，經(jīng)計(jì)算，耐藥組CDR1基因2-△△Ct值明顯高于敏感株組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；而CDR2和MDR1基因2-△△Ct值在耐藥組與敏感組中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.170,P=0.800)，見(jiàn)表3。

表3　　耐藥組和敏感組基因2-△△Ct比較±s)

3討論

白色念珠菌對(duì)吡咯類藥物耐藥主要有以下三條途徑：藥物作用靶位的變化；外排泵基因如CDR1、CDR2、MDR1的過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞對(duì)藥物的主動(dòng)外排，減少了唑類抗真菌藥物在胞體內(nèi)的累積；細(xì)胞膜對(duì)藥物通透性改變，使細(xì)胞攝取和積聚藥物的量降低[3-4]。其中，白色念珠菌的藥物外排能力增強(qiáng)導(dǎo)致胞內(nèi)藥物濃度降低是主要的耐藥機(jī)制。目前已知與吡咯類藥物外排有關(guān)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有兩類：一類是含ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是ATP能量依賴型多藥轉(zhuǎn)運(yùn)載體，是細(xì)胞膜上的外排機(jī)能泵，其與耐藥有關(guān)的主要有CDR1和CDR2基因編碼的Cdr1p蛋白和Cdr2p蛋白；另一類是主要易化載體超家族蛋白，是非能量依賴型載體，其與耐藥有關(guān)的主要是由MDR1基因編碼的Mdr1p蛋白。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Cdr1p、Cdr2p蛋白以降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的方式來(lái)增加藥物的外排[5]，而Mdr1p蛋白則通過(guò)抑制藥物攝入來(lái)實(shí)現(xiàn)。

熒光定量PCR是一種準(zhǔn)確、有效的核酸定量分析技術(shù)，相對(duì)定量主要應(yīng)用于mRNA表達(dá)量解析，先測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)量，再進(jìn)行樣品間相對(duì)量的比較。本研究通過(guò)采用相對(duì)定量TaqMan探針?lè)ǎ雰?nèi)參基因，將目的基因表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，以消除初始RNA的差異帶來(lái)的表達(dá)差異。本研究結(jié)果顯示耐藥組與敏感組CDR1基因在mRNA表達(dá)水平上存在差異，表明耐藥組CDR1基因的高表達(dá)可能與耐藥形成有關(guān)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道白色念珠菌耐藥多以CDR1或CDR2表達(dá)上調(diào)為主[6-7]。CDR1和CDR2基因所編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在氨基酸序列上有高度同源性，所轉(zhuǎn)運(yùn)的底物相似，結(jié)合本課題組前期的結(jié)果[8-9]，本研究認(rèn)為CDR1外排能力更強(qiáng)，在耐藥形成中發(fā)揮作用更大。但CDR2和MDR1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不能證明其與耐藥無(wú)關(guān)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排泵的兩種類型編碼基因的調(diào)節(jié)是相互獨(dú)立的，在大多數(shù)吡咯類藥物耐藥株中僅過(guò)表達(dá)其中一種外排泵；白色念珠菌耐藥性的形成是通過(guò)多因素的調(diào)節(jié)，體內(nèi)長(zhǎng)期演變實(shí)現(xiàn)的，基因表達(dá)增加只是引起耐藥的原因之一。

抗真菌藥物的濫用導(dǎo)致吡咯類藥物產(chǎn)生不同程度的耐藥，應(yīng)從分子水平、生物膜形成等方面進(jìn)一步探究藥物作用靶位，或探索更好的聯(lián)合用藥方案，如李豐霞等[10]發(fā)現(xiàn)漢防己甲素對(duì)氟康唑抗菌活性有增強(qiáng)作用，Zhu等[11]發(fā)現(xiàn)氟康唑和小檗堿聯(lián)合用藥可通過(guò)阻斷CDR1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合藥物作用元件達(dá)到抗菌作用。主動(dòng)外排泵蛋白基因過(guò)度表達(dá)在多藥耐藥產(chǎn)生中的作用已逐漸被重視，本文對(duì)生殖道白色念珠菌耐藥分子機(jī)制的研究有助于發(fā)現(xiàn)新的作用靶位點(diǎn)和研制泵抑制性抗真菌藥物。

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Expression of pyrrole drugs resistance genes in Candida albicans from genital tract*1

LuoMiaoling1,XuYunjian2△,LiQianjun1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HaizhuDistrictFirstPeople′sHospital,Guangzhou,Guangdong510220,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of resistance genes in pyrrole resistant Candida albicans from genital tract.MethodsThe Candida albicans were isolated from the vaginal secretions of 93 vaginitis patients,and Kirby-Bauer method was performed for preliminary culture of strains resistant.The total RNA was extracted from pyrrole-resistant and susceptible Candida albicans isolated by pyrolysis method and cDNA was synthesized.The expression of CDR1,CDR2,MDR1 genes was then detected by Real-time quantitative PCR.ResultsA total of 59 strains of Candida albicans,18 strains of Candida tropicalis,10 strains of Candida krusei and 6 strains of Candida glabrata were cultured.37 strains of Candida albicans were resistant to fluconazole,ketoconazole,and miconazole at different degrees,and the drug resistance rates were 16.7%，18.3%，51.7%;CDR1 gene′s 2(-△△Ct) in sensitive strains group was 1.09±0.27,while resistant strains group was 1.46±0.24,there was significant difference between two groups (t=-4.22,P=0.001).There was no significant difference in the expression of CDR2 and MDR1 genes between the sensitive and resistant strains(P=0.170，P=0.800).ConclusionThe drug resistance of Candida albicans mechanism is complicated,it might be associated with high CDR1 expression,the relationship between CDR2,MDR1 expression and multidrug resistance needs further study.

Key words:genital tract；Candida albicans;genes expression；pyrrole drugs

(收稿日期：2016-01-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.001

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)06-0721-03

基金項(xiàng)目：廣東省臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目(2013)。

作者簡(jiǎn)介：羅妙玲，女，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究。(△)通訊作者，E-mail:vinkent@126.com。