張永志，何洪源，佘彩蒙(中國人民公安大學(xué)　刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京　100038）

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鉤吻素子在小鼠體內(nèi)的組織分布研究

張永志，何洪源，佘彩蒙
(中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100038）

摘要：建立小鼠染毒動物模型，通過尾靜脈給藥確定鉤吻素子的半數(shù)致死量，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對小鼠不同組織臟器進(jìn)行定量分析，確定鉤吻素子主要分布器官。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，確定給藥濃度為20.48 mg/kg、25.6 mg/kg、32 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg，記錄小鼠在給藥0.5 h內(nèi)的死亡時間及數(shù)量，解剖小鼠并對組織臟器進(jìn)行檢測。鉤吻素子對小鼠的半數(shù)致死量為30.60 mg/kg，95%可信區(qū)間為28.10～33.32 mg/kg，由鉤吻素子引起急性中毒死亡后，心臟、肺、腎等臟器是毒素分布的主要器官。實驗確定了鉤吻素子對小鼠的半數(shù)致死量，并對相關(guān)臟器以及血液進(jìn)行定量檢測，為有關(guān)鉤吻素子的毒理研究提供參考，為相關(guān)中毒案（事）件中檢材的選擇以及鉤吻素子的檢測提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鉤吻；鉤吻素子；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；組織分布

何洪源（1965-），女，北京人，中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，博士；

佘彩蒙（1990-），男，北京人，中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院碩士研究生。

鉤吻(Gelsemium elegans Benth)作為一種常見的中草藥，主要分布在我國南方，其藥用價值很高，多為外用，忌內(nèi)服，可用于消腫止痛﹑祛風(fēng)散熱。[1]鉤吻素子(Koumine)屬生物堿類，是鉤吻的主要成分，[2]可用于多種疾病的治療，甚至?xí)蔀橹委熌[瘤和銀屑病的一種新型藥物。[3][4][5]鉤吻素子毒性較大，近些年，隨著鉤吻藥物的開發(fā)與應(yīng)用逐漸深入，相關(guān)的中毒案件也在不斷地增加。[6][7]實驗首先針對鉤吻素子的半數(shù)致死量進(jìn)行研究，再將實驗采集的生物檢材，利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)進(jìn)行定量分析，[8]確定鉤吻素子在小鼠體內(nèi)組織臟器的分布情況，為相關(guān)中毒案（事）件中檢材的選擇以及鉤吻素子的檢測提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料

（一）藥品與試劑

鉤吻素子（購于廣西立安生物有限公司，純度：98%）；乙腈﹑甲酸﹑甲酸銨（美國Fisher Scientific) ；酒精﹑生理鹽水（南京四通化學(xué)用品公司）。

（二）儀器

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（ACQUITY UPLC-XEVO TQ MS,美國Waters公司）；旋渦混合器（BM-2，上海德利科技有限公司）；自動勻漿機（D-15，德國ART MICCRA）；高速離心機（SLCZ-200，江蘇宏達(dá)儀器有限公司）；高速振蕩器（QW-650，北京超越科技有限公司）；電子分析天平（PCY1000，上?？铺仄鞑挠邢薰荆籄CQUITY UPLC BEH C18（ 2.1×50 mm, 1.7 μm）色譜柱（美國Waters公司）。

（三）動物

實驗選用周齡為9周左右的ICR雄性小鼠，共50只，小鼠購于北京斯貝福動物有限公司，體重：（40±2）g，衛(wèi)生級別：VAF/SPF；許可證編號：SCXK（京）2012-0005；合格證編號：0297638。實驗前將小鼠在鼠房適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，保證飼養(yǎng)環(huán)境適宜，鼠具干凈衛(wèi)生，實驗前禁食12 小時，不禁水。本研究的動物實驗標(biāo)準(zhǔn)符合機構(gòu)責(zé)任委員會的倫理（道德）標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)行研究所需的動物實驗。

（四）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取10 mg鉤吻素子，用10 mL乙腈溶解，得到1 mg/mL 的儲備液，將其依次稀釋得到10 ng/mL﹑50 ng/mL﹑100 ng/mL﹑200 ng/mL﹑500 ng/mL﹑1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用0.22 μm的有機濾膜過濾。

二、方法

（一）儀器條件

1.色譜條件

色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm﹑1.7 μm）；流動相：A:乙腈，B:甲酸銨（5 mM）- 0.1%甲酸的水溶液；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣時間：5 min；洗脫程序：0～3 min：流動相A:B 為10:90，3～4 min：流動相A:B為70:30，4～5 min：流動相A:B為10:90。

2.質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）；檢測方式：正離子；毛細(xì)管電壓：3.2 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；脫溶劑氣溫度：400 ℃；錐孔氣流量：50 L/hr；掃描模式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）模式；錐孔電壓：48 V。穩(wěn)定基峰離子為m/z 307.39，兩個子離子碎片分別是m/z 180.35和m/z 167.30，通過比較兩者豐度高低，最后選擇豐度高的前者作為定量離子。100 ng/mL鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM離子色譜圖如圖1所示。

（二）給藥與樣品采集

溶劑選用酒精和生理鹽水（V:V=2:1），前期預(yù)實驗結(jié)果表明：小鼠經(jīng)尾靜脈注射鉤吻素子后，Dn=20 mg/kg，Dm=50 mg/kg。依據(jù)上述結(jié)果，經(jīng)改良寇氏法計算得出實驗劑量分別為20.48 mg/kg﹑25.6 mg/kg﹑32 mg/kg﹑40 mg/kg﹑50 mg/kg，給藥后觀察實驗小鼠在0.5 小時內(nèi)的中毒表現(xiàn)以及死亡時間﹑數(shù)量，之后采集小鼠組織并冷凍保存，用于后期檢測。

圖1　Chromatograms of Koumine with MRM at a level of 100 ng/mL

（三）樣品處理與檢測方法

取上述實驗過程中所得檢材（血液：100 μL，臟器：50 mg并勻漿處理），加入乙腈4 mL，渦旋1 min，先以2000 r/min振蕩15 min，再以8000 r/min離心30 min，最后吸取上層清液并經(jīng)0.22 μm的有機濾膜過濾，進(jìn)樣檢測，檢測條件參照“儀器條件”項，以外標(biāo)曲線法定量。

三、結(jié)果

（一）工作曲線

取小鼠空白血100 μL﹑空白肝50 mg，分別添加濃度為10 ng/mL﹑50 ng/mL﹑100 ng/mL﹑200 ng/mL﹑500 ng/mL﹑1000 ng/mL的鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)液，加入4 mL乙腈，前處理方法參照“樣品處理與檢測方法”項，檢測條件參照“儀器條件”項，得到回歸方程，血：y=109.62x+1198.6，R2=0.9994；肝：y=563.70x+1437.1，R2=0.9993。結(jié)果表明在濃度為10～1000 ng/mL的范圍內(nèi)，鉤吻素子線性關(guān)系良好，且最低檢測限為0.08 ng/mL和0.12 ng/mL （S/N≥3），最小定量限為0.2 ng/mL和0.4 ng/mL（S/N≥10）。

（二）回收率和精密度

取小鼠空白血100 μL﹑空白肝50 mg，分別添加濃度為10﹑100﹑500 ng/mL的鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)液，前處理方法參照“樣品處理與檢測方法”項，檢測條件參照“儀器條件”項，得到日內(nèi)﹑日間精密度。見表1。

表1　Recovery and within- and between-day precisions of Koumine in plasma and liver samples（n=5）

（三）死亡情況和半數(shù)致死量

第1組實驗小鼠在給藥后立即表現(xiàn)出中毒癥狀，小鼠精神萎靡，困倦嗜睡，活動減少，身體發(fā)抖，四肢不穩(wěn)，呼吸變緩，之后其癥狀減輕，無小鼠死亡。實驗2～4組小鼠前期的中毒癥狀與第1組基本相同，但初期中毒癥狀持續(xù)時間變短，之后小鼠出現(xiàn)異常興奮，具體表現(xiàn)為呼吸急促，四肢僵直，全身抽搐，甚至部分小鼠出現(xiàn)痙攣癥狀并最終死亡。第5組小鼠由于給藥劑量大，沒有表現(xiàn)出前期的中毒癥狀，給藥后小鼠呼吸受到明顯抑制，全身僵直并伴有劇烈的抽搐現(xiàn)象，部分小鼠還會出現(xiàn)跳躍和強直性驚厥癥狀，實驗小鼠在很短時間內(nèi)全部死亡。5組實驗小鼠的給藥劑量及死亡情況見表2。

表2　 Dose of Koumine and death rate of mice in the five groups

根據(jù)上述表格中的相關(guān)數(shù)據(jù)以及改良寇氏的計算方法，半數(shù)致死量為30.60 mg/kg，95%可信區(qū)間是28.10～33.32 mg/kg。

（四）組織含量分布

實驗小鼠檢材的前處理方法參照“樣品處理與檢測方法”項，檢測條件參照“儀器條件”項，通過對50只小鼠的臟器及血液進(jìn)行檢測分析，得到鉤吻素子在實驗小鼠各臟器及血液中的含量分布。采用SPSS統(tǒng)計軟件處理所得數(shù)據(jù)，平行3次進(jìn)樣，實驗結(jié)果以平均數(shù)﹑標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計描述。鉤吻素子在小鼠不同臟器及血液中的分布結(jié)果見表3。

四、討論

（一）染毒動物模型

本實驗選用群體動物模型，選擇ICR小鼠作為實驗對象，其優(yōu)點在于穩(wěn)定性好，簡單易復(fù)制，能夠通過大量實驗來保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。[9]實驗結(jié)果證明，動物模型的建立與實際情況相符，可以用于半數(shù)致死量的測定以及毒素的定性定量分析。對于溶劑的選擇，實驗考察了生理鹽水﹑酒精以及兩種溶液的混合，由于鉤吻素子自身理化性質(zhì)的限制，生理鹽水無法將其溶解，而酒精雖能將鉤吻素子溶解，但易引起實驗小鼠的酒精中毒，會對實驗造成影響，因此實驗后期主要考察了酒精與生理鹽水體積比例為1:1 和2:1的兩種情況。實驗發(fā)現(xiàn)，由于小鼠注射體積的限制，對于高劑量的鉤吻素子，1:1的混合溶液無法完全溶解，而體積比為2:1時，能夠?qū)崿F(xiàn)完全溶解，達(dá)到實驗要求，因此選擇酒精與生理鹽水體積比為2:1作為實驗的溶劑。

（二）組織含量分布

表3　Distribution of Koumine (μg/g) after a intravenous administration of Koumine model of mice (x=s,　n=10)

鉤吻素子毒性很強，[10]靜脈注射25.6 mg/kg的鉤吻素子時，小鼠便出現(xiàn)中毒癥狀，甚至部分小鼠死亡。延髓呼吸中樞是鉤吻素子的主要作用區(qū)域，能夠引起呼吸麻痹，導(dǎo)致呼吸衰竭，這是鉤吻素子中毒引起死亡的根本原因。[11][12]鉤吻素子能夠?qū)ο到y(tǒng)造成一定程度的損害，[13][14]對胃﹑腎和肝等臟器作病理觀察時可發(fā)現(xiàn)大量瘀血，臟器粘膜出現(xiàn)充血﹑腫脹。此外鉤吻素子通過作用迷走神經(jīng)，引起心律失常，進(jìn)而對心臟造成損傷。[15]實驗過程中部分小鼠會出現(xiàn)強直性驚厥甚至跳躍現(xiàn)象，這是由于鉤吻素子有類似于γ-氨基丁酸(GABA)拮抗劑的作用。[16]

實驗結(jié)果顯示：鉤吻素子廣泛分布于小鼠體內(nèi)的各臟器中。鉤吻素子的含量以心臟﹑肺和腎最高，血中含量相對較低，肝﹑胰腺﹑肌肉和膀胱的含量居于中等，胃﹑脾和睪丸含量最低。實驗中可以發(fā)現(xiàn)，隨著鉤吻素子給藥量的增加，小鼠中毒癥狀愈加明顯且死亡時間縮短。由于小鼠急性死亡，鉤吻素子在小鼠體內(nèi)無法代謝完全，導(dǎo)致2～5組小鼠體內(nèi)毒素在心臟﹑腎﹑和肺等組織中的含量最高，而第1組小鼠由于給藥劑量不足以致其急性死亡，鉤吻素子在小鼠體內(nèi)得以充分?jǐn)U散和代謝，導(dǎo)致之前毒素含量較低的臟器（如脾﹑胰腺﹑膀胱﹑睪丸等）反而高于其它臟器（如心臟﹑肺﹑腎等）。這一實驗結(jié)果說明鉤吻素子有從血液豐富的臟器(心臟﹑肺﹑腎)向血液不豐富的臟器(脾﹑胰腺﹑膀胱﹑睪丸等)分布擴散的趨勢。

實驗首先建立染毒動物模型，確定了鉤吻素子對小鼠的半數(shù)致死量，并通過對生物檢材中鉤吻素子的定量分析，選取了毒素含量較高的心臟﹑肺﹑腎等臟器作為鉤吻素子急性中毒死亡的靶器官，有利于進(jìn)一步研究鉤吻素子的毒理作用，為相關(guān)中毒案（事）件中檢材的選擇以及鉤吻素子的檢測提供科學(xué)依據(jù)。

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責(zé)任編輯：王燕

The Research on Tissues Distribution of Koumine in Mice

ZHANG Yong-zhi, HE Hong-yuan, SHE Cai-meng
(School of Criminal Science and Technology, People's Public Security University of China, Beijing 100038, China)

Abstract:Objective: A poisoned mice model of koumine was established to research median lethal dose (LD50).A UPLC-MS/MS method was used for qualitative detection and quantitative determination of the distribution of koumine in the bio-samples.Methods: Based on the preliminary experimental results, koumine standards were given to mice intravenously with the concentration of 20.48 mg/kg, 25.6 mg/kg, 32 mg/kg, 40 mg/kg, and 50 mg/kg.The mice were observed for 0.5 hour, toxic symptoms and death time were recorded and inspection of tissues and visceral organs were conducted after dissection.Results: The LD50 of mice is 30.60 mg/kg and 95% confidence interval is 28.10～33.32 mg/kg with the injection of koumine intravenously.Visceral organs with higher toxin distribution than others such as heart, lungs, kidney can be considered as target organ of koumine poisoning.Conclusion: In this research, LD50 and 95% confidence interval has been established and target organs in acute poisoning of koumine in mice has been selected, which can provide target samples and the basis for evaluation for the investigation of the poisoning cases involved in koumine in forensic science field.

Key words:Gelsmium elegans Benth; koumine; UPLC-MS/MS; tissue distribution

DOI:10.13310/j.cnki.gzjy.2016.02.007

[中圖分類號：D918.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-5195（2016）02-0046-05]

作者簡介：張永志（1989-），男，河北任丘人，中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院碩士研究生；

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（81273346）。

收稿日期：2015-10-18