王興玲，蔡鵬飛，張文娟，肖雅琳

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

△女，1962年2月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：生殖內(nèi)分泌與輔助生殖，E-mail：wangxingling123456@163.com

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不同年齡IVF-ET患者卵丘顆粒細胞端粒長度與卵母細胞成熟度及妊娠結(jié)局的關(guān)系

王興玲△，蔡鵬飛，張文娟，肖雅琳

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

△女，1962年2月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：生殖內(nèi)分泌與輔助生殖，E-mail：wangxingling123456@163.com

關(guān)鍵詞體外受精-胚胎移植；卵丘顆粒細胞；端粒長度；卵母細胞成熟度

摘要目的：探討體外受精-胚胎移植(IVF-ET)卵丘顆粒細胞的端粒長度與卵母細胞成熟度及妊娠結(jié)局的關(guān)系。方法：收集81例行體外受精-胚胎移植患者的卵丘顆粒細胞,根據(jù)患者的年齡，分為低齡(<35歲)組42例和高齡(≥35歲)組39例。應(yīng)用qRT-PCR測量卵丘顆粒細胞端粒長度。結(jié)果：卵丘顆粒細胞端粒長度與年齡呈負相關(guān)(r=-0.267，P=0.021)，低、高齡組內(nèi)成熟卵母細胞的卵丘顆粒細胞端粒長度明顯比未成熟卵母細胞的長(P<0.05)。高齡組妊娠者端粒長度較未妊娠者長(P<0.05)。結(jié)論：在IVF-ET中，卵丘顆粒細胞的相對端粒長度隨年齡增長逐漸縮短，可反映卵母細胞的成熟度;端粒長度縮短可能會影響妊娠結(jié)局。

Relationship of telomere length in cumulus cells with oocytes maturation and outcome of IVF-ET in patients with different ages

WANGXingling,CAIPengfei,ZHANGWenjuan,XIAOYalin

ReproductiveCenter,theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsIVF-ET;cumulus cell;telomere length;oocyte maturation

AbstractAim: To investigate the relationship of the relative telomere length in cumulus cells(CCs) with oocytes at different mature stages and the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET). Methods: Oocyte-cumulus complex samples were collected from 81 patients undergoing IVF-ET and CCs were manually separated. A total of 42 women(<35 years,the younger group) and 39 women(≥35 years, the older group) were collected. The oocyte maturation and the result of clinical pregnancy were recorded in different groups. DNA was extracted from CCs and assessed for telomere length by real-time quantitative PCR. Results: There were negative correlation between relative telomere length of CCs with the patients′ age (r=-0.267,P=0.021). The relative telomere length of CCs was higher in mature oocytes than immature oocytes in both groups(P<0.05). There was a significantly higher telomere length of CCs in the pregnant subgroup than in the non-pregnant subgroup among the older group(P<0.05). Conclusion: In IVF-ET, the relative telomere length of CCs gradually shortened with age. The telomere length of CCs could reflect the degree of oocyte maturation and may be associated with pregnancy outcome in IVF-ET.

胚胎質(zhì)量是決定體外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功的關(guān)鍵因素，成熟優(yōu)質(zhì)的卵母細胞是形成高質(zhì)量胚胎的先決條件。直接對卵母細胞和胚胎進行生物學(xué)檢測來評估二者質(zhì)量，存在巨大風(fēng)險和倫理限制。目前臨床上主要應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法篩選卵母細胞和胚胎，由于形態(tài)學(xué)評估方法受到操作者主觀因素的影響，因而存在局限性。卵泡內(nèi)顆粒細胞與卵母細胞及胚胎關(guān)系密切，卵丘顆粒細胞和卵母細胞形成卵丘-卵母細胞復(fù)合體，細胞間存在廣泛的縫隙連接。通過縫隙連接，細胞間相互交換物質(zhì)、相互促進、共同發(fā)育[1]。顆粒細胞的增殖能力影響卵母細胞發(fā)育潛能，顆粒細胞的凋亡程度影響卵母細胞成熟度、胚胎質(zhì)量[2]。細胞的凋亡受端粒和端粒酶調(diào)控，端粒是染色體末端的帽狀結(jié)構(gòu)主要維持基因組的完整性和穩(wěn)定性[3]。隨細胞分裂，端粒不斷縮短，當端?？s短至其閾值時細胞凋亡。研究卵母細胞周圍的顆粒細胞端粒,將為成熟卵母細胞、優(yōu)質(zhì)胚胎選擇提供客觀、準確且無創(chuàng)的方法,從而提高妊娠率；同時為今后深入研究顆粒細胞端粒在未成熟卵體外培養(yǎng)(IVM)中的作用提供實驗基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外關(guān)于IVF-ET中顆粒細胞端粒與卵母細胞及妊娠結(jié)局的相關(guān)研究較少。作者通過測定IVF-ET患者卵丘顆粒細胞端粒的相對長度，研究不同年齡組內(nèi)端粒與卵母細胞成熟及妊娠結(jié)局的關(guān)系，旨在為卵母細胞及胚胎評估提供新的方法。

1對象與方法

1.1研究對象收集 2014年1月至2014年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院因輸卵管因素接受IVF-ET治療的81例患者, 依據(jù)患者年齡分為低齡組(<35歲)42例和高齡組(≥35歲)39例。根據(jù)卵母細胞成熟度分為成熟卵泡顆粒細胞和未成熟卵泡顆粒細胞；移植胚胎后根據(jù)陰道B超是否見到孕囊將患者分為妊娠和非妊娠者。納入標準:①符合輸卵管性不孕的診斷。②男方精液正常。 ③既往月經(jīng)規(guī)律。④近3個月內(nèi)未服用激素類藥物。排除標準:①排卵障礙性疾病(多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥等)。②子宮內(nèi)膜異常(子宮內(nèi)膜異位癥、黏膜下子宮肌瘤等)。③有卵巢手術(shù)史。該研究獲得鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意并簽署同意書。

1.2促排卵方案采用黃體期短效長方案促排卵治療，在黃體中期開始注射短效達菲林進行降調(diào)節(jié)。降調(diào)達標后開始每日注射促性腺激素(gonadotropin,Gn)，啟動劑量為150～300 IU/d；根據(jù)患者卵泡發(fā)育情況適時調(diào)整藥物劑量,當達到至少有3個優(yōu)勢卵泡發(fā)育至直徑為18～20 mm,肌內(nèi)注射重組人絨毛膜促性腺激素(rhCG,默克雪蘭諾公司)250 mg，34～36 h后B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。取卵后第3天，根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)參數(shù)，移植Ⅰ～Ⅱ級胚胎。低齡組患者移植2枚胚胎，高齡組患者移植3枚胚胎。移植后所有患者均給予黃體酮60 mg肌內(nèi)注射及地屈孕酮片(達芙通,蘇威制藥)20 mg口服。移植后14 d檢測血hCG水平，確定生化妊娠者(>5 IU/L)，于移植后第35天經(jīng)陰道B超見孕囊者確定為臨床妊娠。

1.3標本的采集與保存經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵，采用機械法剝除單個卵母細胞周圍的部分卵丘顆粒細胞。將相同成熟度卵母細胞的顆粒細胞混合，在PBS緩沖液中沖洗3次后，將剝離下來的卵丘顆粒細胞收集在微量離心管中。收集顆粒細胞的離心管，置于-80 ℃冷凍保存，實驗備用。患者均采集成熟及未成熟卵母細胞和顆粒細胞。依據(jù)卵母細胞成熟度不同，將對應(yīng)的卵丘顆粒細胞分為：成熟卵母細胞的顆粒細胞(CC-MⅡ)、未成熟卵母細胞的顆粒細胞(CC-MⅠ)。卵母細胞成熟度分級:①MⅡ期形態(tài)表現(xiàn)為卵丘松散，可見透明帶和第一極體，放射冠呈放射狀排列。②MⅠ期表現(xiàn)為卵丘緊密，透明帶不清楚，第一極體尚未排出，放射冠不同程度分散。

1.4提取顆粒細胞的DNA和檢測端粒長度

1.4.1DNA提取從微量離心管中取100 μL卵丘顆粒細胞到1.5 mL的EP管中，加入20 μL蛋白酶K、180 μL GA，混勻后56 ℃水浴30 min；加入200 μL的GB，混勻后70 ℃水浴10 min;加入200 μL的乙醇?；靹蚝髮⑷芤喝哭D(zhuǎn)入吸附柱CR2中，13 400 r/min離心30 s;向CR2中加入500 μL的GD，13 400 r/min離心30 s；向CR2中加入600 μL的PW，13 400 r/min離心30 s,重復(fù)1次；將CR2轉(zhuǎn)入一個干凈EP管中，滴加40 μL的TB，13 400 r/min離心2 min，收集EP管中溶液，-20 ℃保存顆粒細胞DNA。

1.4.2紫外分光光度計測定DNA的純度及濃度取DNA溶液1 μL分別測260、280 nm波長下的光密度(OD)值,然后計算OD260 nm/OD280 nm的比值。OD260 nm/OD280 nm為1.8～2.0，DNA樣品濃度為(72.0±8.6) μg/L。

1.4.3引物的設(shè)計、合成與端粒長度檢測引物設(shè)計參照文獻[1],由上海生工生物工程有限公司合成，PCR反應(yīng)引物序列見表1。Real-time PCR 由北京康為世紀公司提供試劑盒，PCR儀為ABI7500。反應(yīng)體系:上下游引物1 μL、UltraSYBR Mixture 10 μL、模板DNA 2 μL、ddH2O 6 μL，反應(yīng)體系 20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min,擴增40個循環(huán)。每次qRT-PCR反應(yīng)均重復(fù)3次，端粒相對長度參照Cawthon[4]的方法進行分析。

表1　引物序列

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)錄入，SPSS 19.0進行分析，定量資料兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；成熟卵泡顆粒細胞端粒長度與年齡的關(guān)系采用Pearson直線相關(guān)分析。檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1一般情況低齡組妊娠25例、未妊娠17例，高齡組妊娠21例、未妊娠18例。 兩組患者年齡、不孕時間及基礎(chǔ)內(nèi)分泌等基本情況見表2。

表2　低齡組和高齡組患者一般情況比較

2.2CC-MⅡ端粒長度與年齡的關(guān)系低齡組CC-MⅡ端粒長度與高齡組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(4.25±0.93)vs(3.82±0.84)，t=2.514,P=0.030]。隨患者年齡的增加，CC-MⅡ端粒長度逐漸降低，即顆粒細胞的端粒與年齡呈負相關(guān)(r=-0.267，P=0.021)。

2.3顆粒細胞端粒長度與卵泡成熟的關(guān)系 低齡組內(nèi)CC-MⅡ的端粒長度大于CC-MⅠ[(4.25±0.93)vs(3.50±0.84)，t=3.968,P<0.001]；高齡組內(nèi)CC-MⅡ的端粒長度大于CC-MⅠ[(3.82±0.84)vs(3.33±0.79)，t=2.652,P=0.011]。

2.4不同妊娠結(jié)局對應(yīng)的顆粒細胞端粒長度比較低齡組中妊娠者端粒長度與未妊娠者比較[(4.45±0.98)vs(3.95±0.78)]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.789,P=0.081)；高齡組中妊娠者端粒較未妊娠者長[(4.13±0.75)vs(3.47±0.81)，t=2.635,P=0.012]。

3討論

端粒是染色體末端的一種特殊帽狀結(jié)構(gòu)，由重復(fù)串聯(lián)的TTAGGG序列和酶構(gòu)成。端粒維持染色體結(jié)構(gòu)基因的完整性和細胞的增殖能力。研究[5]發(fā)現(xiàn)端粒與生殖能力密切相關(guān)，卵巢儲備下降的婦女其端粒較儲備正常的婦女明顯縮短。然而，端粒受較多因素如端粒酶活性、年齡、環(huán)境因素等的影響。通過培育敲除端粒酶的小鼠發(fā)現(xiàn)，隨繁殖代數(shù)增加、端粒不斷縮短，小鼠逐漸出現(xiàn)獲卵數(shù)少、受精率低、較少的優(yōu)質(zhì)胚胎及不孕等不良結(jié)局[6]。有學(xué)者[7]研究卵泡閉鎖與端粒酶之間關(guān)系發(fā)現(xiàn)，大鼠顆粒細胞中端粒酶在卵泡發(fā)育、成熟中起重要作用；因為端粒酶活性降低致端粒縮短可能與卵泡閉鎖有關(guān)。女性的卵巢功能和卵母細胞質(zhì)量受年齡影響，有學(xué)者[8]認為這可能是年齡增長，細胞復(fù)制次數(shù)增多、營養(yǎng)供應(yīng)不足導(dǎo)致有害代謝產(chǎn)物活性氧基團(ROX)在胞內(nèi)蓄積。ROX結(jié)合到染色體末端的端粒上，使端粒不斷縮短導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因受損，從而影響生殖能力。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)成熟卵泡內(nèi)顆粒細胞端粒長度與年齡呈負相關(guān)。

卵泡發(fā)育、成熟受人類基因組調(diào)控，是一個高度復(fù)雜、有序的過程，在此過程中卵母細胞和顆粒細胞相互作用、同步發(fā)育[9]。顆粒細胞中特定的基因與卵母細胞減數(shù)分裂和胞核成熟密切相關(guān)[10]，顆粒細胞的端粒因端粒酶缺乏不斷縮短，影響顆粒細胞功能，最終阻礙卵母細胞成熟。該研究結(jié)果顯示CC-MⅡ端粒較未成熟的長，這與以往研究[11-12]結(jié)果一致。這可能是在細胞分裂過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生了大量的氧自由基，氧自由基對重復(fù)序列TTAGGG中鳥嘌呤特別敏感[13]。通過過氧化作用使其中的氨基和亞氨基被氧化加速端粒隱縮，從而導(dǎo)致功能基因受損、染色體斷裂，顆粒細胞衰老、凋亡。顆粒細胞內(nèi)大量的凋亡信號經(jīng)縫隙連接進入卵母細胞，影響卵母細胞質(zhì)量。Cheng等[11]認為擁有較長端粒的顆粒細胞可為卵泡的發(fā)育提供適宜的微環(huán)境，有利于形成優(yōu)質(zhì)成熟的卵母細胞和高質(zhì)量胚胎。

顆粒細胞凋亡率和卵泡的發(fā)育及胚胎移植后妊娠結(jié)局密切相關(guān)[2]。作者對不同年齡段患者妊娠和未妊娠者顆粒細胞端粒進行比較，發(fā)現(xiàn)高齡組妊娠者顆粒細胞端粒較長，但低齡組妊娠和未妊娠患者中無此差異。Biron-Shental等[14]研究發(fā)現(xiàn)在適齡婦女中，未妊娠婦女端粒較妊娠的明顯縮短；他認為端?？s短對胎盤功能有不利影響，導(dǎo)致胚胎宮內(nèi)生長受限及不良的妊娠結(jié)局。該研究未發(fā)現(xiàn)低齡組妊娠、未妊娠者端粒長度差異，可能是收集樣本量較小的原因。Keefe等[15]通過追蹤IVF妊娠結(jié)局的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠組胚胎對應(yīng)的極體中的端粒較未妊娠組的更長。Cheng等[11]研究不同級別胚胎對應(yīng)的顆粒細胞端粒顯示：優(yōu)質(zhì)胚胎所對應(yīng)的顆粒細胞的明顯較長。Chen等[16]的研究表明顆粒細胞中端?？梢苑从陈涯讣毎团咛ブ械亩肆Ｇ闆r。該研究發(fā)現(xiàn)顆粒細胞的端粒與妊娠結(jié)局可能存在關(guān)聯(lián)。這可能是調(diào)控顆粒細胞端?？s短的信息通過某種作用機制影響卵母細胞和胚胎，從而對妊娠結(jié)局產(chǎn)生影響。有關(guān)顆粒細胞與胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局之間的具體分子機制有待進一步研究。

綜上所述，在IVF過程中，卵丘顆粒細胞對卵母細胞的成熟和胚胎發(fā)育有著不可或缺的作用。顆粒細胞的凋亡程度直接影響卵泡發(fā)育和胚胎質(zhì)量，端粒和端粒酶與凋亡密切相關(guān)。加深對顆粒細胞端粒的研究，延緩端粒縮短，將可能促進體外培養(yǎng)的卵母細胞成熟；進而改善卵母細胞和胚胎質(zhì)量，提高IVF的妊娠率。

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中圖分類號R711.6

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.023