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姜黃素對(duì)魚藤酮損傷的多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用

潘峰△

南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽 473000

△男，1985年4月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：癲癇及神經(jīng)系統(tǒng)變性病變，E-mail：pppfff850423@163.com

關(guān)鍵詞姜黃素；魚藤酮；內(nèi)源性抗氧化酶；多巴胺能神經(jīng)元

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一。目前PD治療以應(yīng)用多巴胺的替代品左旋多巴或多巴胺受體激動(dòng)劑為主，這些藥物雖能有效緩解PD的臨床癥狀，但長期用藥會(huì)產(chǎn)生療效減退、癥狀波動(dòng)、運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥。原則上PD一旦被診斷就應(yīng)及早予以保護(hù)性治療，其目的是延緩疾病的發(fā)展、改善患者的癥狀。氧化應(yīng)激在PD的進(jìn)展過程中占有主導(dǎo)地位[1-2]。氧化應(yīng)激損傷涉及氧化應(yīng)激和抗氧化系統(tǒng)的失衡，早期給以抗氧化劑可能限制氧化損傷。姜黃素(curcumin,Cur)是從姜黃中提取的酚性色素，為姜黃的主要有效成分,具有抗氧化作用[3]。作者以魚藤酮(rotenone,Ro)損傷大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞為氧化應(yīng)激損傷模型，觀察Cur對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，為Cur對(duì)PD治療的基礎(chǔ)研究打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.2細(xì)胞模型的建立[4]PC12細(xì)胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，武漢大學(xué))，在含PRIP 1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%馬血清、體積分?jǐn)?shù)5% FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、雙抗)塑料培養(yǎng)瓶中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)1% FBS的培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，8 h后用含50 μg/L NGF、體積分?jǐn)?shù)1% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天2/3原體積換液。誘導(dǎo)7 d待細(xì)胞間長出網(wǎng)狀纖維、形成類交感神經(jīng)元細(xì)胞即為帕金森病細(xì)胞模型建立。

1.3MTT檢測細(xì)胞活性對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按每孔1×104mL-1的密度種入96孔板內(nèi)，每孔200 μL。設(shè)對(duì)照組，Ro組(1 μmol/L)，Ro+0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L Cur組，0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L Cur組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞誘導(dǎo)7 d，Ro組加入1 μmol/L Ro，Ro+0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L Cur組加入1 μmol/L Ro和對(duì)應(yīng)濃度的Cur，0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L Cur組只加入對(duì)應(yīng)濃度的Cur，對(duì)照組只加培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。每孔加5 g/L MTT溶液20 μL。繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸盡孔內(nèi)上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min。酶標(biāo)儀在波長570 nm處讀取吸光度(A)值。細(xì)胞活性=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)。

1.4活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平測定對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按每孔4×104mL-1的密度種入24孔板內(nèi)，每孔600 μL。設(shè)Ro組、Cur組、Ro組+Cur組、(活性氧陽性)對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞誘導(dǎo)7 d，藥物處理24 h后，離心棄上清，按ROS檢測試劑盒說明進(jìn)行操作后，按200 μL/孔加入96孔板，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長535 nm，用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光量，即為ROS水平。

1.5總谷胱甘肽含量測定對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按每孔4×104mL-1的密度種入12孔板內(nèi)，每孔1.2 mL。設(shè)Ro組、Cur組、Ro組+ Cur組、對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞誘導(dǎo)7 d，藥物(1 μmol/L的Ro和Cur)處理24 h后，收集細(xì)胞，離心盡棄上清。按總谷胱甘肽檢測試劑盒要求操作后，將96板中待測物在酶標(biāo)儀下用波長412 nm測A值，即為細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0分析，各組細(xì)胞活性變化的比較采用單因素方差分析，各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平、總谷胱甘肽含量以及Nrf2蛋白表達(dá)量的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1各組PC12細(xì)胞活性的變化見表1。

表1　各組PC12細(xì)胞活性比較

F=15.877,P<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與Ro組比較，P<0.05。

2.2各組PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平見表2。

表2　各組PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平

FRo=35.010,P<0.001；FCur=60.010,P<0.001；FCur×Ro=101.853,P<0.001。

2.3各組PC12細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量見表3。

表3　各組PC12細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量

FRo=35.481,P<0.001；FCur=53.371,P<0.001；FCur×Ro=37.781,P<0.001。

2.4各組PC12細(xì)胞胞質(zhì)與胞核中Nrf2蛋白表達(dá)量見圖1、2和表4、5。Ro組、對(duì)照組中Nrf2蛋白幾乎全部定位在細(xì)胞質(zhì)中，而Cur處理之后，細(xì)胞胞質(zhì)中Nrf2蛋白量急劇減少，Nrf2幾乎全部定位于胞核。Cur可激活Nrf2，使其從胞質(zhì)移位于胞核。

1：Cur組；2：Ro組；3：Cur+Ro組；4：對(duì)照組。圖1　各組細(xì)胞胞質(zhì)中Nrf2蛋白的表達(dá)

1：Cur組；2：Ro組；3：Cur+Ro組；4：對(duì)照組。圖2　各組細(xì)胞胞核Nrf2蛋白的表達(dá)

RoCur+-+0.20±0.020.87±0.04-0.28±0.030.89±0.07

FRo=65.351,P<0.001；FCur=37.278,P<0.001；FCur×Ro=56.832,P<0.001。

表5　各組細(xì)胞胞核中Nrf2表達(dá)水平的比較

FRo=38.721,P<0.001；FCur=54.321,P<0.001；FCur×Ro=72.241,P<0.001。

3討論

Ro是一種從魚藤膠中分離的化學(xué)物質(zhì)，毒性很大，脂溶性很強(qiáng)，易穿過血腦屏障和細(xì)胞膜，穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后在亞細(xì)胞器內(nèi)發(fā)生聚集。研究[4]表明PC12細(xì)胞對(duì)Ro的作用較為敏感，10 nmol/L即可引起PC12 細(xì)胞凋亡，且隨藥物濃度的增加而增加，并在1 μmol/L Ro作用下出現(xiàn)半數(shù)致死[5]。張海娜等[6]用Ro成功地模擬了PD的兩個(gè)主要特征：黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元的變性死亡和胞質(zhì)內(nèi)Lewy小體的形成，即細(xì)胞凋亡和蛋白聚集，初步建立了Ro作用下PC12細(xì)胞損傷的PD細(xì)胞模型。在NGF的誘導(dǎo)下，PC12細(xì)胞向類似神經(jīng)元方向分化，在形態(tài)、生理、生化及功能等方面接近于中腦的DA能神經(jīng)元，被廣泛應(yīng)用于研究PD的細(xì)胞模型[7]。

PD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其基本的病理特征為黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元進(jìn)行性變性、死亡。氧化應(yīng)激被在PD的進(jìn)展過程中占有主導(dǎo)地位。氧化應(yīng)激是細(xì)胞氧化-抗氧化失衡而導(dǎo)致的應(yīng)激損傷狀態(tài)，在這種狀態(tài)下細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)不能使ROS維持在非細(xì)胞毒性水平，當(dāng)ROS的生成增加而其清除減少，或者對(duì)氧化修飾的大分子修復(fù)減少時(shí)，氧化應(yīng)激就會(huì)發(fā)生[8]。DCFH-DA是一種自身不發(fā)熒光的化合物，它能自由透過細(xì)胞膜，被胞質(zhì)內(nèi)ROS氧化為熒光化合物DCF。DCF能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，通過檢測DCF的熒光強(qiáng)度，反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

Nrf2是轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其調(diào)控作用通過抗氧化物反應(yīng)元(antioxidant response elements，ARE)實(shí)現(xiàn)[9]。Nguyen等[10]發(fā)現(xiàn)Nrf2/ARE系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗氧化酶，從而增強(qiáng)了細(xì)胞清除ROS的能力，以此來維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡和降低氧化損傷。研究[11-12]結(jié)果提示，Nrf2/ARE信號(hào)通路對(duì)于多種類型細(xì)胞(胚胎成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞等)抵抗氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有重要意義。Cur被證實(shí)在視網(wǎng)膜細(xì)胞、肝細(xì)胞中能通過激活Nrf2/ARE信號(hào)通路、誘導(dǎo)多種的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力，從而細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。Cur對(duì)MPP介導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡提供顯著的細(xì)胞保護(hù)作用[13]。

在采用6-OHDA建立的PD動(dòng)物模型中[14]，Cur可抑制黑質(zhì)酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞凋亡，并能維持紋狀體的DA水平。潘靜等[15]指出在建立的MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中，Cur可以有效地拮抗MPTP誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失，其機(jī)制可能與Cur降低黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元活性氧含量以及抑制炎癥反應(yīng)等作用有關(guān)。然而，Cur在上述PD模型中的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制是否與Nrf2/ARE信號(hào)通路活化有關(guān)，并未得到深入的研究。該研究結(jié)果顯示:1.0 μmol/L Cur處理后， PC12細(xì)胞活性較Ro組增加最多，保護(hù)作用最強(qiáng)。作為外源性Nrf2誘導(dǎo)劑，Cur在低濃度范圍內(nèi)能通過激活Nrf2/ARE信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶，主要是內(nèi)源性抗氧化酶(還原性谷胱甘肽)的活性，清除細(xì)胞內(nèi)ROS，發(fā)揮抗氧化作用，從而使ROS的產(chǎn)生與抗氧化的不平衡狀態(tài)改善，從而減輕了Ro誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的損傷，但隨著濃度增加，保護(hù)作用降低，甚至起促氧化作用?？偣入赘孰氖悄X組織內(nèi)重要的非蛋白性抗氧化劑及氧化還原調(diào)節(jié)因子。研究[16]發(fā)現(xiàn)，Cur可以提高多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的總谷胱甘肽水平，并經(jīng)silico模型實(shí)驗(yàn)表明，這一效應(yīng)是由Cur誘導(dǎo)的GCL基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)所致。該研究結(jié)果表明，經(jīng)Cur處理過的致?lián)pPC12細(xì)胞，Nrf2蛋白的表達(dá)主要出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)，而對(duì)照組和Ro組中Nrf2蛋白的表達(dá)主要出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

綜上所述，Cur可能通過激活Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化活性及細(xì)胞(包括神經(jīng)元)保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)帕金森病及運(yùn)動(dòng)障礙學(xué)組.中國帕金森病治療指南[J].中華神經(jīng)科雜志,2009,42(3):352

[2]MILLER RL，JAMES-KRACKE M,SUN GY,et al.Oxidative and inflammatory pathways in parkinson′s disease[J].Neurochem Res,2009,34(1):55

[3]M KHOPDE S,PRIYADARSINI KI,VENKATESAN P,et al.Free radical scavenging ability and antioxidant efficiency of curcumin and its substituted analogue[J].Biophys Chem,1999,80(2):85

[4]胡丹,孫圣剛.魚藤酮對(duì)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12的毒性作用[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2008,3(5):298

[5]王翔宇,楊紅衛(wèi),梅元武.姜黃素對(duì)多巴胺誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,34(1):115

[6]張海娜,胡國華,陳秋惠,等.帕金森病細(xì)胞模型的建立及魚藤酮對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,33(5):811

[7]WANG G,QI C,FAN GH,et al.PACAP protects neuronal differentiated PC12 cells against the neurotoxicity induced by a mitochondrial complex Ⅰ inhibitor, rotenone[J].FEBS Lett,2005,579(18):4005

[9]CHEN F,SHI XL.Intracellular signal transduction of cells in response to carcinogenic metals[J].Crit Rev Oncol Hematol,2002,42(1):105

[10]NGUYEN T,SHERRATT PJ,PICKETT CB.Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2003,43(2):233

[11]李強(qiáng),趙曙光,王旭霞,等.姜黃素激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對(duì)人肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2010,19(2):154

[15]潘靜,丁健青,陳生弟.姜黃素對(duì)帕金森病小鼠模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志,2007,7(5):447

[16]JAGATHA B,MYTHRI RB,VALI S,et al.Curcumin treatment alleviates the effects of glutathione depletion in vitro and in vivo: therapeutic implications for Parkinson's disease explained via in silico studies[J].Free Radic Biol Med,2008,44(5):907

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.034