王立英，蘇海燕，李春穎，吳殿秀，劉楠楠

(1.北華大學基礎醫(yī)學院，吉林 吉林　132013；2.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春　130021)

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?；撬峥剐募〕衫w維細胞增殖作用的實驗研究

王立英1，蘇海燕2，李春穎1，吳殿秀1，劉楠楠1

(1.北華大學基礎醫(yī)學院，吉林 吉林132013；2.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春130021)

摘要：目的 研究?；撬?Taurine，Tau)對血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導新生大乳鼠心肌成纖維細胞(myofibroblasts，myoFbs)增殖的抑制作用，并探討其作用機制.方法 用AngⅡ誘導新生大乳鼠myoFbs增殖，建立心肌纖維化(myofibrosis，MF)模型.采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖；羥脯氨酸試劑盒檢測膠原含量；免疫細胞化學染色檢測p-PKCα的膜轉(zhuǎn)位及表達；Western blot檢測p-PKCα和p-ERK1/2蛋白表達及含量.結(jié)果 Tau(30，60，120)mmol/L可明顯抑制AngⅡ誘導的MyoFbs增殖及膠原合成，同AngⅡ組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性.應用免疫細胞染色Western blot并且結(jié)合圖像分析，結(jié)果表明：Tau可抑制p-PKCα膜轉(zhuǎn)位和表達，與AngⅡ組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01).結(jié)論 Tau可能通過減少p-PKCα的表達及膜轉(zhuǎn)位，從而抑制MyoFbs增殖和膠原含量的增加，抑制MF，逆轉(zhuǎn)心肌重塑.

關鍵詞：牛磺酸；心肌成纖維細胞；血管緊張素Ⅱ；蛋白激酶Cα；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2

【引用格式】王立英，蘇海燕，李春穎，等.?；撬峥剐募〕衫w維細胞增殖作用的實驗研究[J].北華大學學報(自然科學版)，2016，17(2)：200-204.

Tau又稱β-氨基乙磺酸，是機體內(nèi)含量非常豐富的氨基酸，具有防病治病的多種生理功能.迄今為止，已發(fā)現(xiàn)Tau具有促進嬰幼兒智力和腦組織的發(fā)育、防止心血管病、增強人體免疫、調(diào)節(jié)晶體滲透壓、調(diào)節(jié)Ca2+濃度穩(wěn)態(tài)及抗氧化作用等功效[1].近年來，又發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤及心血管保護等作用[2]，是重要的保護心肌損傷的物質(zhì).已證明Tau在Iso致Wistar大鼠MF損傷中顯示出抗MF的作用[3- 4].本研究擬在細胞水平上探討Tau對于MyoFbs增殖的抑制作用，并進一步探討其作用機制.

1材料與方法

1.1實驗動物

Wistar大鼠的乳鼠，1～3日齡，清潔級，雌雄兼用(吉林大學醫(yī)學部實驗動物中心，合格編號：SCXK 2010-0008).

1.2藥品與試劑

?；撬?中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司)；MTT和AngⅡ(美國Sigma公司)；血清和IMDM(美國Gibco公司)；p-PKCα一抗(即羊抗大鼠的p-PKCα抗體)及ERK1/2一抗(羊抗大鼠的p-ERK1/2抗體)(美國Santa cruz公司)；羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物有限工程公司)；胰蛋白酶(寶泰克生物制品科技公司)；二抗(兔抗山羊抗體)(中杉金橋生物有限公司)；S-P試劑檢測盒(福州邁新生物技術(shù)公司)；碘化丙啶(美國Biotium公司)；DAB顯色液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司).

1.3實驗儀器

CO2孵箱(HERAEUS)；超凈工作臺(AIR TECH)；倒置顯微鏡(OLYMPUS CK40)；酶標儀(SUNRISE)；低溫離心機(SORVALL)；GIS天能凝膠成像系統(tǒng)(上海).

1.4MyoFbs分離及培養(yǎng)

Wistar大鼠的乳鼠(1～3日齡)，無菌條件下開胸取出心臟，涼的D-Hank’s液洗兩次，剪切成1 mm3大的碎片，用濃度為0.125%的胰蛋白酶多次消化，收集各次消化的上清液，離心，棄上清，用胎牛血清(濃度10%)的IMDM培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液，重新接種在培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).實驗中采用3～5代的MyoFbs.

1.5實驗分組及給藥

將MyoFbs細胞分為正常對照組、AngⅡ模型組、Tau組、PKCα抑制劑(D4681 0.625 mg/L)組和ERK1/2的抑制劑(PD98095 25 mmol/L)組.各組MyoFbs無血清培養(yǎng)12 h后，均給予1%濃度血清的IMDM及終濃度為1×10-7mol/L的AngⅡ(除對照組外均給)，藥物治療組給予終濃度分別為30，60，120 mmol/L的Tau.

1.6細胞增殖的測定

將3～5代的MyoFbs制成懸液，以濃度1×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL.待長勢較好時分別應用上述的各項處理因素作用48 h.每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/L)，37 ℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，結(jié)束培養(yǎng)，每孔加DMSO150 μL，震蕩10 min，于490 nm波長的酶標儀上檢測吸光度(A)值，以A值(給藥組)/A值(對照組)× 100%表示MyoFbs的增殖率.

1.7測定Ⅰ，Ⅲ型膠原的含量

采用第3代MyoFbs制成懸液，接種于24孔培養(yǎng)板(濃度2.5×105個/mL，每孔1 mL).按照上述方法處理各實驗組，于培養(yǎng)48 h后收集各組上清液，檢測Ⅰ，Ⅲ型膠原的量.

1.8免疫細胞化學染色檢測p-PKCα膜轉(zhuǎn)位和p-ERK1/2核轉(zhuǎn)位及表達

將第3代MyoFbs放入預先放置了10 mm×10 mm蓋玻片的24孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，各組無血清培育12 h后，各處理因素作用MyoFbs 24 h，取出生長有MyoFbs的小蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次約5 min，多聚甲醛(濃度4%)固定30 min，自然干后進行細胞化學染色.SP法陽性反應呈現(xiàn)棕黃色顆粒，用PBS代替一抗，其染色為陰性對照.采用Image-Pro Plus5.0V圖像分析軟件進行各組的p-ERK1/2和p-PKCα在MyoFbs中表達的平均光密度值分析[17].

1.9Western blot檢測p-ERK1/2和p-PKCα蛋白的表達

細胞分組及處理同1.6，按文獻[5]方法提取MyoFbs膜性組分的PKCα及胞核中的ERK1/2.各取50 μg蛋白，用SDS-PAGE分離.電轉(zhuǎn)移PKCα及ERK1/2蛋白至PVDF膜，用3%胎牛血清白蛋白封閉PVDF膜，置于4 ℃冰箱過夜，再加入p-ERK1/2和p-PKCα抗體；二抗(1∶500的辣根過氧化物酶標記兔抗山羊抗體)，孵育2 h.DAB顯色液顯色，GIS凝膠成像系統(tǒng)檢定蛋白質(zhì)印跡條帶的灰度.

1.10統(tǒng)計學分析

2結(jié)果

2.1Tau對MyoFbs增殖的影響

MTT法結(jié)果表明：AngⅡ組MyoFbs增殖率明顯高于對照組(P<0.001)，經(jīng)Tau(120，60，30)作用MyoFbs 48 h后，MyoFbs增殖率均降低，與AngⅡ組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)，且呈量效關系.特異性PKCα抑制劑D4681組和ERK1/2的抑制劑PD98095組細胞增殖率降低，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1).

2.2Tau對膠原含量的影響

各因素作用MyoFbs 48 h后，AngⅡ組MyoFbs分泌的Ⅰ，Ⅲ型膠原含量高于對照組(P<0.01)，Tau(120，60，30)可抑制AngⅡ誘導MyoFbs膠原的合成(P<0.05).特異性PKCα抑制劑D4681組和ERK的抑制劑PD98095組Ⅰ，Ⅲ型膠原的含量降低，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).結(jié)果見表1.

表1?；撬釋π募〕衫w維細胞分泌膠原含量的影響

Tab.1Effect of Tau on the collagen content of neonatal rats MyoFbs induced by AngⅡ

注：與對照組比較，**：P<0.001；與AngⅡ組比較，▲：P<0.05，△△：P<0.01

2.3Tau對MyoFbs p-PKCα膜轉(zhuǎn)位及表達的影響

各處理因素作用48 h后，免疫細胞化學染色可見對照組細胞中有少量p-PKCα的膜轉(zhuǎn)位和表達，而AngⅡ模型組細胞中p-PKCα的膜轉(zhuǎn)位和表達較多，明顯高于對照組(P<0.01).Tau(30，60和120)可不同程度的抑制p-PKCα的膜轉(zhuǎn)位和表達(P<0.05)(見圖2).

2.4Tau對MyoFbs p-ERK1/2核轉(zhuǎn)位及表達的影響

各處理因素作用48 h后，免疫細胞化學染色和熒光共聚焦可見模型組細胞胞核明顯深染，且數(shù)量較多，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01).Tau(30，60和120)可不同程度地抑制p-ERK1/2的核轉(zhuǎn)位和表達(P<0.05)(見圖3).

2.5Tau對MyoFbs的p-PKCα表達的影響

Western blot及凝膠成像檢測發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，AngⅡ組的p-PKCα蛋白量增加(P<0.001)；Tau 60，120 mmol/L劑量組、特異性PKCα抑制劑D4681與Tau 60 mmol/L組p-PKCα蛋白的表達量低于AngⅡ組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001或P<0.01)，而單純D4681組p-PKCα蛋白表達量比AngⅡ模型組低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05).以上結(jié)果說明Tau與D4681抑制p-PKCα蛋白表達具有協(xié)同效應(見圖4).

2.6Tau對MyoFbs的p-ERK1/2表達的影響

Western blot及凝膠成像檢測發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，AngⅡ組的p-ERK1/2蛋白的表達增加(P<0.01)；Tau 60 mmol/L和120 mmol/L劑量組、Tau 60 mmol/L與PD98095組的p-ERK1/2表達量低于AngⅡ組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01).說明Tau通過抑制p-ERK1/2蛋白表達抑制MyoFbs的增殖，且PD98095能加強Tau的抑制作用(見圖5).

3討論

MyoFbs的異常增殖是MF發(fā)生的基礎，MF主要的病理改變是MyoFbs產(chǎn)生的ECM在心肌中的堆積，造成室壁僵硬，收縮有障礙，因而目前治療MF的重要靶點是抑制產(chǎn)生ECM的MyoFbs的增殖[6].在誘發(fā)MF的諸多因素中，AngⅡ發(fā)揮了至關重要的作用[7].本實驗擬在細胞水平來觀察Tau對AngⅡ誘導MyoFbs增殖、Ⅰ和Ⅲ型膠原、p-PKCα膜轉(zhuǎn)位和表達及p-ERK1/2核轉(zhuǎn)位及表達的影響，進一步探討Tau對于MyoFbs增殖的抑制作用，并初步揭示其作用機制.

以往研究顯示：Tau可抑制AngⅡ誘導的MyoFbs增殖[8-10]，但其具體的作用機制不清楚.本研究在以往工作基礎上，進一步探討Tau抑制MyoFbs增殖及抗MF的作用，探討其與p-PKCα及p-ERK1/2之間的相互關系，明確其作用機制.為此本實驗通過免疫細胞化學染色和Western blot等不同的實驗方法來研究.

在心肌細胞PKC各亞型中，PKCα表達量最高[9]，但目前研究較少.一些研究[10-11]表明：心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程中，PKCα起到正性調(diào)控作用.任何一種PKC亞型的活性程度都與它的磷酸化程度、表達水平及細胞內(nèi)定位有關，磷酸化后將由胞質(zhì)向胞膜移位.本實驗中發(fā)現(xiàn)Tau抑制MyoFbs增殖及減少膠原合成時，也抑制p-PKCα的蛋白表達和膜轉(zhuǎn)位.由此可知：AngⅡ促進MyoFbs增殖時，有p-PKCα參與此過程.為進一步揭示PKCα在Tau抑制AngⅡ誘導MyoFbs增殖中的作用機制，實驗中選擇運用了PKCα特異性的抑斷劑D4681對MyoFbs增殖進行干預.實驗結(jié)果表明：與AngⅡ組相比較，D4681組的MyoFbs增殖率降低、膠原生成量減少；D4681與Tau聯(lián)合應用可加強此作用；此結(jié)果掲示PKCα參與到了AngⅡ誘導的MyoFbs增殖過程，抑制p-PKCα的膜轉(zhuǎn)位及表達就可抑制MyoFbs的增殖，進而逆轉(zhuǎn)MF.

細胞信號調(diào)節(jié)激酶1/2 是ERK1/2家族重要成員之一，其表達廣泛，并且涉及調(diào)節(jié)細胞多種生物學行為[12-13].諸多刺激因子如細胞因子、生長因子、病毒及細菌等均可致此條信號通路激活，從而誘導細胞分化、增殖、生長、細胞周期變化及凋亡等[14-16].PD98059能特異性地阻斷劑ERK1/2信號通路.許多年來，曾有許多學者利用PD98059特異性阻斷ERK1/2信號通路的激活，探討此信號通路在調(diào)節(jié)細胞生物學功能及行為中的作用.本實驗發(fā)現(xiàn)Tau抑制MyoFbs增殖及膠原合成時，也抑制了p-ERK1/2的蛋白表達和核轉(zhuǎn)位.應用ERK1/2特異性的阻斷劑(PD98059)對MyoFbs進行阻斷干預，與AngⅡ組比較膠原含量和細胞增殖率都明顯降低.Western blot結(jié)果顯示：PD98059組p-ERK1/2蛋白表達顯著低于AngⅡ組.由此可知：p-ERK1/2參與到了AngⅡ誘導MyoFbs增殖過程，Tau可抑制p-ERK1/2的蛋白表達及核轉(zhuǎn)位，抑制MyoFbs的增殖，進而抑制MF發(fā)生.

本實驗研究結(jié)果：Tau可降低MyoFbs的A值及減少Ⅰ，Ⅲ型膠原的含量，表明Tau可抑制MyoFbs的增殖及MF的發(fā)生；同時Tau可減少p-PKCα膜轉(zhuǎn)位及表達、p-ERK1/2核轉(zhuǎn)位及表達.因而說明Tau通過抑制p-PKCα和p-ERK1/2的轉(zhuǎn)位和表達，進而抑制MyoFbs增殖及膠原合成，抑制MF.本研究對Tau通過PKCα和ERK1/2等信號分子抑制AngⅡ誘導的MyoFbs的增殖和MF的機制進行了初步的探討，但其具體的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路還需進一步的研究.

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【責任編輯：陳麗華】

Experimental Study on Effect of Taurine on the Anti-proliferation of Myofibroblasts

Wang Liying1，Su Haiyan2，Li Chunying1，Wu Dianxiu1，Liu Nannan1

(1.BasicMedicalCollegeofBeihuaUniversity，Jilin132013，China；2.JilinTumorHospital，Changchun130021，China)

Abstract：Objective To investigate the effect of Taurine(Tau)on inhibiting the proliferation of myoFbs of the neonatal rats induced by angiotensinⅡ(AngⅡ)，and to explore its mechanism.Methods The myoFbs proliferation of the cultured neonatal rat was induced by AngⅡ，and was detected with thiazole blue(MTT)colorimetric assay.The levels of collagenⅠand collagen Ⅲ were measured by hydroxyproline kit.Translocation and expression of p-PKCα in cells membrane or nuclear were determined by the immunohistochemistry staining with image analysis software.The expression and content of p-PKCα and p-ERK1/2 in cells were determined with western technology and gel imaging system.Results MyoFbs proliferation and hydroxyproline content in the culture medium were markedly inhibited when myoFbs were dealed with Tau at the concentrations of (120，60 and 30)mmol/L for 24 h(P<0.01，P<0.05，respectively)，and showed dose-dependent.Immunocytochemistry，western blot and image analysis system showed that Tau could inhibit the expression and membrane translocation of p-PKCα，and further inhibit the nuclear translocation and expression of p-ERK1/2.These results showed statistically significant difference compared with AngⅡ group(P<0.01).Conclusion These results suggest that Tau can inhibit the proliferation of myoFbs and the increase of collagen content by inhibiting the translocation and expression of p-PKCα in membrane，and then inhibit MF and reverse cardiac remodeling.

Key words：taurine；myofibroblasts；angiotensinⅡ；protein kinase Cα；extracellular signal regulated kinase1/2

中圖分類號：R994.6

文獻標志碼：A

作者簡介：王立英(1974-)，女，博士，副教授，主要從事心血管藥理學研究，E-mail：ly741023@126.com；通信作者：劉楠楠(1976-)，女，博士，講師，主要從事免疫病理學研究，E-mail：liunn1976@163.com.

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30873066/C180102)；吉林市科技發(fā)展計劃項目(201536058)；北華大學博士啟動基金(199500033).

收稿日期：2015-06-10

文章編號：1009-4822(2016)02-0200-05

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.012