張捷+李勤霞+張萍+余甜

摘要： 利用正交設計對新疆野核桃序列相關擴增多態(tài)性PCR（SRAP-PCR）反應體系中的5個因素（模板DNA、Mg2+、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶濃度）在5水平上進行優(yōu)化，對比不同濃度模板DNA對擴增結果的影響，建立了新疆野核桃SRAP最佳反應體系。結果表明，優(yōu)化的新疆野核桃SRAP-PCR最佳反應體系為：20 μL的反應體系中，2.5 μg/mL模板DNA、0.4 μmol/L引物、2 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、25 U/mL Taq酶U；最佳PCR擴增程序的退火溫度為54 ℃。各因素擴增結果表明，Mg2+濃度對擴增反應結果影響最大，dNTPs濃度影響最小。運用該體系對新疆野核桃樣本進行了驗證，表明該體系擴增穩(wěn)定可靠。用該體系對100個SRAP引物組合進行篩選，篩選出15個擴增條帶清晰且多態(tài)性豐富的引物組合，為新疆野核桃種質資源研究奠定了基礎。

關鍵詞： SRAP分子標記；新疆野核桃；正交試驗；引物篩選；體系優(yōu)化

中圖分類號： S664.103 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0064-03

新疆野核桃（Juglans regia L.）是胡桃科胡桃屬植物，也是栽培核桃（Uuglms regia L.）的野生種之一[1]，在我國僅分布于新疆伊犁鞏留縣（后稱野核桃溝自然保護區(qū)）內，是我國珍貴的天然野生資源[2-4]。

國內目前對于新疆野核桃領域的研究薄弱，而分子標記技術已經在核桃的遺傳多樣性分析[5-13]、分子標記輔助育種[14]、特異性基因標記[15-16]和遺傳圖譜的構建[17]等方面普遍應用，但其飽和程度不高，不能滿足科研工作發(fā)展的需要。本研究利用正交設計試驗對新疆野核桃序列相關擴增多態(tài)性PCR（SRAP-PCR）反應體系進行了優(yōu)化[18-20]，考察SRAP-PCR反應體系中各因素的相互影響[21]，得到最佳優(yōu)化組合。與單因素試驗相比，不但可以快速獲得試驗結果，而且減少了試驗的成本和工作量。并對100對SRAP引物進行了多態(tài)性標記篩選，得到一些多態(tài)性較高的SRAP引物組合[22-24]，為進一步研究新疆野核桃種質資源遺傳多樣性打下了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材料 試驗材料為從新疆伊犁鞏留縣野核桃溝內采集的野核桃葉片。

1.1.2 試劑 根據(jù)Li等已發(fā)表的SRAP引物[25]設計10條正向引物、10條反向引物序列（表1），由深圳華大基因科技服務有限公司合成；10×Taq Buffer（含Mg2+）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Ladder（100 bp）、10×Loading buffer均購于北京全式金生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 以新疆野核桃的幼嫩葉片為材料，利用改良高鹽低pH值法提取基因組DNA[20]，干燥后加入1× TE溶解沉淀，檢驗質量后于-20 ℃條件下長期保存。試驗所提取的DNA沉淀為白色，經風干后呈透明黏狀。在0.8%的瓊脂糖凝膠中，于100 V電壓下電泳1 h，經0.5 μg/mL EB染色，然后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照檢測DNA質量。

1.2.2 PCR反應體系優(yōu)化的正交試驗設計 利用L25（55）正交設計試驗[21]，對模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和Taq聚合酶濃度進行5因素5水平篩選試驗（表2）。

1.2.3 SRAP-PCR擴增程序及擴增產物的檢測 制備總體積為20 μL的PCR 反應體系，除變化因素外，其余的用ddH2O補足，所用的引物組合為F2+R3，引物序列見表1。SRAP-PCR的擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性 1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，54 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。擴增反應在Thermal Cycler S1000型PCR儀上進行，擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（電泳儀電源為 DYY-10C型，電泳儀為DYCZ-20C型），快速銀染法顯色，清水清洗，裹上保鮮膜，最后在膠片觀察燈上觀察并拍照保存。

1.2.4 多態(tài)性SRAP引物組合的篩選 根據(jù)表2設計的正交優(yōu)化試驗方案確定新疆野核桃SRAP-PCR的最佳反應體系，用10條正向引物和10條反向引物組成的100對引物組合對48份不同區(qū)域的新疆野核桃材料進行多態(tài)性SRAP引物組合的篩選。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取

利用改良高鹽低pH值法所提取的新疆野核桃基因組DNA，經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，表明DNA完整（圖1）。通過UV2000紫外分光光度計對DNA濃度進行檢測，測得D260 nm/D280 nm的比值在1.8～2.0之間。由此可知，經上述方法提取的新疆野核桃DNA的質量較高，能夠滿足SRAP反應對DNA的要求。

2.2 正交設計優(yōu)化SRAP-PCR的結果分析

依據(jù)“1.2.2”節(jié)中設定的正交試驗，進行PCR擴增反應和聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)電泳結果（圖2），統(tǒng)計擴增條帶數(shù)量，將結果輸入SPSS 19.0軟件進行方差分析（表3）。

從電泳結果可以看出，第6、10、15泳道電泳條帶多且清晰，都可作為新疆野核桃正交試驗組合，但從經濟性考慮，最后選擇第15個組合為新疆野核桃SRAP-PCR最佳反應組合。

從方差分析中能夠看出，5種PCR因子的F值大小依次為：Mg2+濃度>引物濃度>Taq酶濃度>模板DNA濃度>dNTPs濃度，這表明Mg2+濃度對新疆野核桃SRAP-PCR的反應體系有最大的影響。

依據(jù)上述試驗結果，確定新疆野核桃SRAP-PCR的最優(yōu)反應體系為：2.5 μg/mL模版DNA、2 mmol/L Mg2+、0.4 μmol/L 引物、0.2 mmol/L dNTPs、25 U/mL Taq酶，剩余體積用去離子水補齊至20 μL；最佳PCR擴增程序的退火溫度為 54 ℃，相應SRAP-PCR擴增程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，5個循環(huán)；94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。

2.3 SRAP-PCR反應體系的驗證

從不同引物組合中隨機選取引物分別對48個樣品DNA進行擴增驗證（圖3）。結果表明該反應體系能得到較好的結果，且在不同的引物組合之間和不同的DNA樣品之間帶型有明顯差異，擴增出的譜帶較清晰且多態(tài)性較豐富。

2.4 SRAP-PCR多態(tài)性引物組合的篩選

應用“2.2”節(jié)建立的新疆野核桃SRAP-PCR的反應體系，用由10個上游引物、10個下游引物組成的100對 SRAP-PCR的引物組合對48份新疆野核桃樣品進行SRAP擴增，每個擴增試驗都重復3次，并選取條帶清晰且重復性較好的結果進行分析。最后篩選出15對條帶清晰，多態(tài)性好的引物組合：F1/R2、F1/R5、F1/R7、F2/R2、 F2/R3、F2/R4、F3/R2、F3/R3、F3/R4、F5/R1、F5/R2、F5/R5、F6/R8、F6/R9、F6/R10。其中F3/R2擴增結果見圖4。

3 結論與討論

SRAP作為一種新型的分子標記技術，不但具有多態(tài)性高、擴增穩(wěn)定、引物通用和產量中等的特點，而且重復性較好，操作簡易。然而，SRAP分子標記的擴增結果容易受PCR反應條件（比如DNA、dNTPs、Mg2+濃度、引物和Taq聚合酶用量等）和基因組的影響，并且不同的植物對SRAP-PCR反應體系的要求也各不相同[21]。所以，對反應體系進行優(yōu)化是進行SRAP分析的前提條件。

試驗結果表明：Mg2+濃度對SRAP-PCR反應體系的結果影響最大，而模板濃度和退火溫度的變化對SRAP-PCR反應體系影響相對較為輕微。本試驗建立了適合新疆野核桃的SRAP-PCR優(yōu)化體系，模版DNA濃度為2.5 μg/mL、Mg2+濃度為2.0 mmol/L、引物濃度為0.4 μmol/L、dNTPs濃度為 0.2 mmol/L、Taq酶濃度為25 U/mL，剩余體積用去離子水補齊至 20 μL。利用該體系篩選出15對擴增產物條帶清晰并且多態(tài)性較豐富的引物組合。新疆野核桃SRAP-PCR優(yōu)化體系的建立和引物組合的篩選為野核桃種質資源的遺傳多樣性分析研究奠定了良好的基礎。

利用本研究的反應體系，能擴增出條帶清晰、多態(tài)性豐富的譜帶，且重復性好、穩(wěn)定性強，這為今后新疆野核桃在SRAP這種新型分子標記方面的研究提供了依據(jù)，也為新疆野核桃通過SRAP分子標記技術在種質資源遺傳多樣性和野核桃遺傳圖譜的構建方面提奠定了基礎。

參考文獻：

[1]張 釗，嚴兆福. 新疆野生核桃的調查研究[J]. 新疆農業(yè)科學，1962（10）：404-407.

[2]張新時. 伊犁野果林的生態(tài)地理特征和群落學問題[J]. 植物學報，1973，15（2）：239-253.

[3]王家友. 伊犁野生核桃林的初步調查[J]. 新疆林業(yè)，1980（6）：27-31.

[4]新疆維吾爾自治區(qū)自然保護區(qū)考察隊.新疆的野核桃林[J]. 林業(yè)科技通訊，1982（10）：15-18.

[5]金 強，楊 宇，王新建，等. 新疆核桃種質資源遺傳多樣性AFLP分析[J]. 江蘇農業(yè)科學，2009（2）：28-31.

[6]王 磊. 新疆野核桃、野櫻桃李和野扁桃[J]. 新疆農業(yè)科學，1990，27（1）：33-34.

[7]王 磊，李 霞，楊 遼，等. 新疆野核桃種質資源數(shù)量分類研究[J]. 北方園藝，1998（1）：5-7.

[8]王 磊，崔乃然，張漢斐. 新疆野核桃的研究[J]. 干旱區(qū)研究，1997，14（1）：17-27.

[9]徐德炎. 新疆野核桃生態(tài)氣候特征的研究[J]. 生態(tài)學雜志，1989，8（4）：24-27.

[10]徐德炎，朱曉專. 新疆野核桃生存繁衍的生態(tài)條件研究[J]. 中國林副特產，1991（4）：1-6.

[11]佘定域. 鞏留野核桃林土壤的形成及其特征特性[J]. 干旱區(qū)研究，1994，11（2）：11-15.

[12]劉立誠，排祖拉，徐華君. 伊犁谷地野核桃林下土壤的形成特點及其系統(tǒng)分類[J]. 新疆大學學報：自然科學版，1998，15（2）：60-65.

[13]王肇延. 新疆野核桃資源及遺傳多樣性的分析[D]. 烏魯木齊：新疆農業(yè)大學，2011：22-27.

[14]曾 斌. 新疆野生核桃資源的現(xiàn)狀與發(fā)展[J]. 北方果樹，2005（4）：1-3.

[15]張 維，趙 玉，張相鋒，等. 新疆伊犁野核桃復葉的表型變異及生長規(guī)律[J]. 東北師大學報：自然科學版，2011，43（1）：113-117.

[16]劉曉麗，陳學森，張美勇，等. 普通核桃（Juglans regia）3個群體遺傳結構的SSR分析[J]. 果樹學報，2008，25（4）：526-530.

[17]司 鵬. 蘋果分子遺傳圖譜構建及其部分性狀SRAP分析[D]. 北京：中國農業(yè)科學院，2010.

[18]楊向暉，黃建峰，傅嘉欣，等. 黃皮SRAP反應體系優(yōu)化正交實驗研究[J]. 亞熱帶植物科學，2009，38（4）：27-30.

[19]王 燕；龔義勤；趙統(tǒng)敏. 番茄SRAP-PCR體系優(yōu)化與品種分子鑒定[J]. 南京農業(yè)大學報，2007，30（1）：23-29.

[20]王肇延，董玉芝，陳 虹，等. 適用于新疆野核桃SSR-PCR的快速提取DNA的方法[J]. 北方園藝，2011（19）：100-103.

[21]鄭軼琦，王志勇，郭海林，等. 正交設計優(yōu)化假儉草SRAP-PCR反應體系及引物篩選[J]. 草業(yè)學報，2008，17（4）：110-117.

[22]張安世，邢智峰，劉永英，等. SRAP分子標記及其應用[J]. 安徽農業(yè)科學，2007，35（9）：2562-2563.

[23]李巧燕，林瑞慶，朱興全. SRAP分子標記及其應用概述[J]. 熱帶醫(yī)學雜志，2006，6（4）：467-469，封四.

[24]李 超，羅淑萍，秦 偉，等. 新疆核桃親緣關系的ISSR分析[J]. 新疆農業(yè)科學，2010，47（9）：1722-1727.

[25]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.