蔣景龍

摘要： 為揭示H2O2和生長素在山黧豆[Lathyrus quinquenervius （Miq.） Litv.]初生根發(fā)育中的作用，外源性施加H2O2或生長素處理山黧豆初生根，并分析初生根的形態(tài)變化，檢測內源H2O2和生長素水平變化。結果顯示：施加H2O2阻止了初生根向地性生長而誘導其發(fā)生水平方向彎曲；施加吲哚-3-丁酸（IBA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和α-萘乙酸（α-NAA）能夠完全抑制由外源H2O2引起的初生根水平彎曲；在施加外源H2O2條件下，添加生長素的極性運輸抑制劑2，3，5-三碘苯甲酸（TIBA）與1-萘氨甲酰苯甲酸（NPA），不能抑制初生根水平彎曲；外源H2O2處理降低了初生根內源的吲哚乙酸（IAA）和H2O2水平。研究結果表明，外源H2O2影響內源H2O2與IAA水平，導致初生根的水平彎曲。

關鍵詞： 過氧化氫（H2O2）；初生根；彎曲；生長素；山黧豆

中圖分類號： Q945.78 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0121-03

過氧化氫（H2O2）作為一種信號分子在植物的生長發(fā)育過程中參與了許多生理活動，如氣孔的運動、細胞壁的木質化、根的向地性生長、側根的發(fā)育、細胞程序化死亡與花粉和柱頭的相互作用等[1]。此外，當遭受輕度生物或非生物脅迫時，植物體內產(chǎn)生的H2O2能夠通過參與各種信號轉導，調節(jié)植物的代謝（如光合作用、呼吸作用、蒸騰作用）和防衛(wèi)系統(tǒng)（如抗氧化脅迫的酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)），使植物獲得生物或非生物脅迫的抗性[2-3]。因此，H2O2成為當今細胞與分子生物學研究領域的熱點，但大多數(shù)研究主要集中在內源H2O2參與植物的生長發(fā)育及對各種環(huán)境刺激的應答方面，而外源H2O2如何影響植物生長發(fā)育方面的研究卻鮮有報道[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，外源H2O2處理山黧豆[Lathyrus quinquenervius （Miq.） Litv.]種子能夠抑制初生根向地性生長并誘導發(fā)生水平方向彎曲。在胚根突破種皮后，面對的外部環(huán)境比較復雜，種子萌發(fā)的后期，其生長發(fā)育會受到一些環(huán)境因子如重力、水分、營養(yǎng)及其他化學物質刺激的影響而發(fā)生根形態(tài)的變化。很多研究表明，初生根的向地性彎曲生長與生長素的不對稱性分布、水平變化和極性運輸有關[5]。當植物根被水平放置時，根尖會感受到重力的刺激，然后將這種信號進行轉化與傳遞，從而影響生長素的極性運輸，最終在伸長區(qū)表現(xiàn)出上側的細胞中生長素濃度較低，而下側細胞內的生長素濃度較高，出現(xiàn)了生長素的局部不對稱性分布，最終表現(xiàn)出在伸長區(qū)發(fā)生向重力性的彎曲生長[6-7]。生長素存在獨特的運輸機制，只能在細胞與細胞之間進行極性運輸。而這一極性運輸?shù)倪^程又可被其極性運輸抑制劑2，3，5-三碘苯甲酸（TIBA）和1-萘氨甲酰苯甲酸（NPA）所抑制。本研究同時用外源的生長素、H2O2與生長素的極性運輸抑制劑組合處理，檢測H2O2與生長素含量變化來研究H2O2誘導的初生根水平彎曲與生長素之間的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山黧豆種子均由蘭州大學細胞活動與逆境適應教育部重點實驗室的細胞研究所302實驗室提供。挑選籽粒飽滿、無損壞的定西山黧豆、阿克蘇山黧豆和扁莢山黧豆種子，用自來水沖洗3次，然后將洗凈的山黧豆種子分別用不同濃度的H2O2處理60 h。H2O2的濃度分別為10、20、40 mmol/L。只加蒸餾水而沒有加H2O2的設為對照組，H2O2處理了60 h后重新放入到水中培養(yǎng)24 h的為恢復組。以上所有的山黧豆種子均水平放置在培養(yǎng)皿的底部，即胚根的方向與培養(yǎng)皿的底面相平行。

1.2 試驗方法

采用H2O2與生長素、H2O2與生長素極性運輸抑制劑的組合處理。

吲哚乙酸（IAA）在空氣中容易氧化，選擇吲哚-3-丁酸（IBA）代替IAA。另外，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和α-萘乙酸（α-NAA）均是生長素的類似物。TIBA、NPA均為生長素的極性運輸抑制劑，其中只加外源H2O2的組作為對照。

1.3 H2O2與IAA的含量檢測方法

H2O2與IAA的含量檢測分別參照Jiao等的方法[8]和Dobrev等的方法[9]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 7.5 SR1和SPSS 16.0軟件進行制圖和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 外源H2O2抑制向地性生長并誘導初生根的水平彎曲

由圖1-a所示，將定西山黧豆、阿克蘇山黧豆和扁莢山黧豆種子水平放置在盛有少許蒸餾水的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，36 h后胚根突破種皮，由于重力的作用，48～60 h初生根開始沿著重力的方向發(fā)生向地性彎曲。將這些種子同樣水平放置在盛有不同濃度H2O2的培養(yǎng)皿中，它們的初生根則不會發(fā)生正常的向地性彎曲，而沿著水平方向發(fā)生彎曲（圖1-a）。這種彎曲的方式不同于向地性彎曲，其彎曲的方向與向地性彎曲相互垂直，因此稱為水平彎曲。僅施加H2O2的初生根會發(fā)生水平彎曲（圖1-b-A）；當同時施加IBA和H2O2或2，4-D和H2O2時，初生根既沒有發(fā)生水平彎曲也沒有發(fā)生向地性彎曲（圖1-b-B）；當同時施加α-NAA和H2O2時，水平彎曲生長被完全逆轉且在胚軸的部位與對照組相比還明顯地發(fā)生了加粗生長（圖1-b-C）。

2.2 H2O2與生長素、H2O2與生長素抑制劑處理對根水平彎曲的影響

IBA抑制初生根水平彎曲存在著劑量關系，即IBA的濃度越高，抑制水平彎曲的作用就越明顯，低于最低濃度閾值，IBA不能抑制初生根的水平彎曲（表1）。當IBA的濃度為 1.0×10-3～1.0×10-2 μmol/L時，初生根的彎曲率達 79.97% 以上，表明低濃度的IBA對初生根的水平彎曲率的抑制效果不明顯；但當IBA的濃度超過1.0 μmol/L時，初生根的水平彎曲率僅為17.77%。這些數(shù)據(jù)表明，施加的IBA濃度越高，抑制作用越明顯。在一些有生長素參與的植物生長發(fā)育中，如果用生長素的特異性極性運輸抑制劑如TIBA、NPA處理，會抑制一些正常的生長發(fā)育，例如植物根的向地

性生長。在本試驗中，同時施加2種生長素的極性運輸抑制劑TIBA或NPA與H2O2進行處理，結果發(fā)現(xiàn)用5～50 μmol/L TIBA 或NPA處理，均不能抑制由H2O2誘導的初生根的水平彎曲。

2.3 外源H2O2處理影響了初生根內源H2O2和生長素水平

通過雙酶法對初生根內的H2O2含量進行檢測，結果如圖2所示。對照組初生根內的H2O2含量為0.85 μmol/g，而經(jīng)H2O2處理后初生根內的H2O2含量明顯低于對照組，但10、20、40 mmol/L H2O2處理組之間并沒有顯著性的差異。將處理了60 h的山黧豆幼苗重新放回水中恢復24 h后，內源H2O2水平再次升高，但仍低于對照組中的H2O2含量（圖3），這表明外源施加H2O2處理降低了內源的H2O2積累。

同時通過高效液相色譜方法檢測初生根內的IAA水平。結果顯示，對照組初生根的生長素鮮質量含量達到了 1.6 μg/g，而20 mmol/L H2O2處理60 h的初生根中的生長素含量不足1.2 μg/g，降低了大約25%（圖4），這表明施加外源H2O2后，初生根內源的生長素水平顯著降低。

3 結論與討論

過氧化氫作為一種信號分子在植物體內發(fā)揮了許多重要作用，近幾年越來越多的研究者開始選擇通過施加外源性的H2O2處理植物的方法來研究其對植物生長發(fā)育的影響[10-11]。外源H2O2能夠促進大麥、百日草、菠菜、豌豆、樟腦等種子的萌發(fā)[12]。外部環(huán)境因子能影響植物根的形態(tài)和結構，而植物的根也能在最初感受刺激后作出相應的應答[13]。在面對各種環(huán)境刺激后，植物的根系能夠表現(xiàn)出一種不對稱的生長模式，例如卷曲、彎曲、螺旋、波浪、傾斜等[14]。Li等的研究表明，施加外源H2O2能與生長素相互作用誘導黃瓜、綠豆的不定根生長[15-16]。Joo 等在玉米初生根的向地性生長研究中發(fā)現(xiàn)，活性氧（主要是H2O2）在生長素的下游參與了向地性應答的信號轉導[17]。本研究結果顯示，外源性施加H2O2不僅阻止了山黧豆初生根的向地性生長，還引起了初生根在水平方向上發(fā)生形態(tài)學的彎曲現(xiàn)象。初生根的彎曲一般由根兩側的細胞伸長速率差異引起，而這種差異又往往與生長素的分布和極性運輸有關。當同時施加一定濃度的H2O2、生長素的類似物如IBA，2，4-D或α-NAA時，這種水平彎曲明顯地被抑制，而且隨著生長素類似物濃度的提高，幾乎可以完全抑制這種由H2O2引起的水平彎曲。外源的H2O2降低了內源生長素的水平，而這可能更有利于植物根細胞兩側形成不對稱的生長素分布，從而導致水平彎曲的發(fā)生。至于是否促進了生長素的不對稱性分布，如何促進根兩側細胞形成生長素的不對稱性分布等問題，還需要通過對初生根局部區(qū)域生長素進行定位研究。

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