李龍騰，葉艷芳，胡殿宇，鞏治華

(鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州　450052)

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外源性硫化氫對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷后腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響

李龍騰，葉艷芳，胡殿宇，鞏治華

(鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州450052)

摘要：目的研究外源性硫化氫(H2S)對(duì)腸缺血再灌注損傷(I/RI)后腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響，為臨床治療腸I/RI的新藥開發(fā)提供依據(jù)。方法以硫氫化鈉(NaHS)作為硫化氫的外源性供體，將32只健康雄性Wistar大鼠分為四組：(A)正常對(duì)照組、(B)假手術(shù)組、(C)腸IR/I模型組、(D)腸IR/I+H2S(NaHS,14umol/kg)干預(yù)組，每組8只。通過HE染色觀察小腸組織的形態(tài)學(xué)改變，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腸黏膜細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果腸IR/I+H2S組比腸IR/I組的腸黏膜損傷明顯減輕，腸黏膜細(xì)胞的凋亡率也明顯降低。結(jié)論在腸I/RI中，H2S能降低腸黏膜細(xì)胞的凋亡，起到保護(hù)腸黏膜的作用。

關(guān)鍵詞：硫化氫；缺血再灌注損傷；腸；細(xì)胞凋亡

腸缺血再灌注損傷(I/RI)是臨床上常見的病理生理過程。研究表明，腸黏膜細(xì)胞凋亡是腸I/RI時(shí)細(xì)胞死亡的主要形式[1]。H2S作為一種新型的氣體信號(hào)分子，可以在體內(nèi)大部分組織中生成，參與多種生理與病理過程。研究表明，硫化氫對(duì)心肌、肺缺血再灌注損傷的細(xì)胞凋亡都有抑制作用[2-3]。但是H2S對(duì)腸I/RI腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響尚未見報(bào)道。本研究通過建立腸I/RI模型，探討H2S對(duì)腸I/RI大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠32只，體重大約180 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑及器材

硫氫化鈉(NaHS)，Sigma公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國Beckman公司產(chǎn)品；AnnexinV-FITC/PI試劑盒，美國BD公司產(chǎn)品。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及腸缺血再灌注損傷模型的制作。32只健康雄性Wistar大鼠，禁食12 h后稱重。隨機(jī)分為四組，實(shí)驗(yàn)在相對(duì)無菌的環(huán)境下進(jìn)行，并注意給動(dòng)物保暖。(A)正常對(duì)照組：不給予任何干預(yù)措施，麻醉后取材。(B)假手術(shù)組：麻醉后打開腹腔，僅用手翻動(dòng)腸道，1 h后縫合腹腔，4 h后麻醉取材。(C)腸I/RI模型組：麻醉后打開腹腔，夾閉腸系膜上動(dòng)脈造成腸缺血，1 h后打開動(dòng)脈夾再灌注前腹腔注射生理鹽水，然后再灌注4 h后麻醉取材。(D)腸I/RI+H2S干預(yù)組：麻醉后打開腹腔，夾閉腸系膜上動(dòng)脈造成腸缺血，1 h后打開動(dòng)脈夾再灌注前腹腔注射NaHS(H2S的外源性供體,14 umol/kg)，然后再灌注4 h后麻醉取材。

1.3.2HE染色觀察腸黏膜的形態(tài)學(xué)改變。在相對(duì)無菌的條件下，迅速打開腹腔取出腸組織，用生理鹽水沖洗干凈后，置于10%的甲醛溶液中固定，然后包埋、切片并進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察腸黏膜組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腸黏膜細(xì)胞的凋亡率。將黏膜從腸組織上分離下來，迅速置于冷PBS中進(jìn)行勻漿，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，濾液以1000 r/min離心5 min，棄上清，用DMEM培養(yǎng)基吹打混勻成細(xì)胞懸液備用；將碎組織塊以1:10加入0.1%的膠原酶，置于37 ℃的水浴中，用磁力棒攪拌、過濾、離心，制成細(xì)胞懸液。將所有分離的細(xì)胞懸液調(diào)整成密度為1×106/ml單細(xì)胞懸液，分裝于離心管中，然后用冰凍PBS洗滌細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞并置于加有100 ul冷buffer液的試管中，試管放置于冰上。在試管內(nèi)加入5 ulAnnexinV-FITC和2.5 ulPI進(jìn)行熒光標(biāo)記，輕微混勻，避光孵育10 min，加入400 ul冰預(yù)冷的buffer液，輕微混勻，30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果分析

2.1H2S對(duì)腸黏膜的病理形態(tài)學(xué)影響

圖1為H2S對(duì)腸膜的病理形態(tài)學(xué)影響。HE染色顯示：正常對(duì)照組(圖1A)和假手術(shù)組(圖1B)腸黏膜絨毛完整，黏膜、黏膜下層和肌肉層分層清晰；與正常組相比，腸I/RI模型組(圖1C)腸黏膜顯示損傷嚴(yán)重，黏膜游離面可見散在的潰瘍和出血灶，鏡下可見黏膜上皮細(xì)胞脫落，絨毛斷裂，頂端上皮抬高變尖，伴有部分上皮層同固有層分離，黏膜下層可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；腸I/RI+H2S干預(yù)組(圖1D)腸黏膜有輕度損傷，絨毛上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，有增生增厚現(xiàn)象,黏膜下見散在的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),未見毛細(xì)血管和淋巴管擴(kuò)張。

A:正常對(duì)照組　B:假手術(shù)組　C:腸I/RI模型組

2.2H2S對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷后腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，腸I/RI模型組與腸I/RI+H2S干預(yù)組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但腸I/RI+H2S干預(yù)組細(xì)胞凋亡率比腸I/RI模型組又有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組細(xì)胞凋亡率比正常對(duì)照組略有增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

A:正常對(duì)照組　B:假手術(shù)組　C:腸I/RI模型組

3討論

由于在內(nèi)臟器官中，腸組織對(duì)缺血比較敏感，所以嚴(yán)重外傷、大面積燒傷、出血性休克等應(yīng)激狀態(tài)下都存在有不同程度的腸I/RI，并因此可能造成腸粘膜屏障功能障礙和腸道菌群移位，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，引起肝、肺、腎等多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致死亡。

大量研究表明：細(xì)胞凋亡是腸I/RI腸黏膜損傷的重要原因之一[4]，而且主要發(fā)生在再灌注的1 t到6 t之間[5]。本實(shí)驗(yàn)缺血再灌注模型采用缺血1 t再灌注4 t，經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)：腸黏膜上皮細(xì)胞脫落，絨毛斷裂，頂端上皮抬高變尖，伴有部分上皮層同固有層分離，黏膜下層可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腸I/RI模型組的腸黏膜損傷嚴(yán)重，說明本實(shí)驗(yàn)成功地復(fù)制了腸I/RI模型。并且通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腸I/RI模型組的腸黏膜細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，所以在腸I/RI的治療中必須重視腸黏膜細(xì)胞的凋亡。

近些年，H2S在細(xì)胞凋亡中的作用得到廣泛關(guān)注，NaHS作為H2S供體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于H2S的研究當(dāng)中。因?yàn)樵谌芤褐兴軌蚍纸鉃镹a+和HS-，HS-和H+結(jié)合產(chǎn)生H2S[6]。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射NaHS來干預(yù)腸I/RI。HE染色表明，干預(yù)后腸黏膜的損傷明顯減輕，通過流式細(xì)胞術(shù)再次證明H2S可以減輕腸I/RI中腸黏膜細(xì)胞凋亡。

4結(jié)語

在腸缺血再灌注損傷中，腸黏膜有明顯損傷，腸黏膜細(xì)胞也有明顯的凋亡，而H2S能夠在一定程度上改善這種損傷和凋亡情況，而且在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們將繼續(xù)更深入探討可能的作用機(jī)制，希望能夠?yàn)榕R床新藥的開發(fā)提供更多的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[責(zé)任編輯：方艷]

The Effects of Exogenous Hydrogen Sulfide on Intestinal Mucosal Cell Apoptosis after Intestinal Ischemia-reperfusion Injury in Rat

LI Longteng, YE Yanfang, HU Dianyu, GONG Zhihua

(Zhengzhou Railway Vocational and Technical College，Zhengzhou 450052, China)

Abstract:Objective: To study the effects of exogenous hydrogen sulfide (H2S)on intestinal mucosal cell apoptosis after intestinal ischemia-reperfusion injury(I/RI). Methods: Sodium hydrosulfide(NaHS)was taken as a donor of H2S. 32 Wistar rats were divided equally into 4 groups: (A)Nomal group(B)Sham operation group (C)Intestinal I/RI model group(D)Intestinal I/RI+H2S(NaHS,14umol/kg)group. Intestinal tissue alteration was observed with HE assay.The apoptosis of intestinal mucosal cells was measured by flow cytometry. Results:Compared with I/RI group, the intestinal mucosal injury and cell apoptosis of I/RI+H2S group was significantly reduced. Conclusion: In the intestinal I/RI, H2S can reduce the apoptosis of intestinal mucosal cells, and can also protect the intestinal mucosa.

Key words:hydrogen sulfide; ischemia reperfusion injury; intestinal; cell apoptosis

中圖分類號(hào):R364.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1008-6811(2016)01-0048-03

作者簡(jiǎn)介：李龍騰(1979—)，男，河南商丘人，鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部講師。葉艷芳(1981—)，女，河南許昌人，鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部助教。胡殿宇(1965—)，女，河南延津人，鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院教授。鞏治華(1961—)，男，山西左權(quán)人，鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部副教授。

基金項(xiàng)目：鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院重點(diǎn)科技課題(2013JKY004)；河南省科技廳2015年河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目(152300410183)

收稿日期：2015-12-08