樊 航，閆鈺鑫，蔡 歡，張 澎，婁源航，王國

1. 河南大學醫(yī)學院，河南 開封 475004； 2. 河南大學民生學院，河南 開封 475004

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鏡檢法與染色法對旋毛蟲成囊前幼蟲的檢查效果比較

1. 河南大學醫(yī)學院，河南 開封 475004； 2. 河南大學民生學院，河南 開封 475004

摘要：〔目的〕 觀察鏡檢法與染色法對旋毛蟲成囊前幼蟲的檢查效果?！卜椒ā?30只雌性昆明小鼠隨機分為6組，每組5只。1組：每鼠經(jīng)口感染20條旋毛蟲肌幼蟲，感染13 d剖殺；2組：每鼠經(jīng)口感染20條旋毛蟲肌幼蟲，感染14 d剖殺；3組：每鼠經(jīng)口感染20條旋毛蟲肌幼蟲，感染18 d剖殺；4組：每鼠經(jīng)口感染100條旋毛蟲肌幼蟲，感染13 d剖殺；5組：每鼠經(jīng)口感染100條旋毛蟲肌幼蟲，感染14 d剖殺；6組：每鼠經(jīng)口感染100條旋毛蟲肌幼蟲，感染18 d剖殺。鏡檢法、染色法檢查膈肌、腹肌中的幼蟲?！步Y果〕 鏡檢法檢查：1組、2組、4組、5組均未檢出幼蟲；3組膈肌、腹肌幼蟲檢出率分別為60%、40%；6組膈肌、腹肌幼蟲檢出率均為100%。染色法檢查：1組未檢出幼蟲；2組、3組、4組、5組、6組小鼠膈肌幼蟲檢出率分別為60%、100%、80%、 100%、100%； 腹肌檢出率分別為40%、100%、80%、 80%、100%。3組染色法膈肌幼蟲每克蟲荷均數(shù)高于腹肌(膈與腹染色q3=3.42，P<0.05)；6組染色法膈肌幼蟲每克蟲荷均數(shù)顯著高于腹肌(膈與腹染色q6=7.63，P< 0.01)；3組、6組膈肌幼蟲每克蟲荷均數(shù)，染色法均顯著高于鏡檢法(膈鏡檢與染色q3=5.24，q6=8.90，P<0.01)；6組腹肌幼蟲每克蟲荷均數(shù)，染色法高于鏡檢法(腹鏡檢與染色q6=4.17，P<0.05)?！步Y論〕 旋毛蟲感染早期的成囊前幼蟲病原學檢查結果，與感染數(shù)量、檢查方法和取材部位均有關。 感染較重的宿主，其寄生幼蟲在肌細胞中出現(xiàn)時間，早于感染較輕的宿主；染色法優(yōu)于鏡檢法；膈肌檢出率高于腹肌。

關鍵詞：旋毛蟲；成囊前期幼蟲； 鏡檢法；染色法；檢查

旋毛形線蟲(Trichinella spiralis)是旋毛蟲病(Trichinellosis)的病原體，簡稱旋毛蟲，可寄生于人與多種哺乳動物體內(nèi)。成蟲和幼蟲寄生在同一宿主，成蟲主要寄生在宿主的十二指腸和空腸上段，幼蟲寄生在橫紋肌細胞內(nèi)，形成具有感染性的幼蟲囊包[1]。任何年齡、性別、職業(yè)的人群均易受染[2]，這種危害嚴重的人獸共患疾病主要因宿主食入含有活旋毛蟲幼蟲的肉類而感染。文獻[3]報道， 旋毛蟲感染早期的未成囊幼蟲對新宿主已具有感染性。鏡檢法是旋毛蟲病原學檢查常用方法[4]，對成囊幼蟲的檢出效果較好，但對旋毛蟲感染早期的成囊前幼蟲檢出效果有待探討。本實驗采用鏡檢法和染色法，對旋毛蟲感染早期的成囊前幼蟲進行檢查，并對病原學檢查結果進行了比較，為旋毛蟲病的預防和檢測提供了實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1旋毛蟲蟲種及肌幼蟲收集

旋毛蟲蟲種為本實驗室引自河南省疾病預防控制中心，用小白鼠傳代保種的旋毛蟲(Trichinella spiralis)，實驗前以肌幼蟲轉(zhuǎn)種小白鼠備用。每鼠經(jīng)口感染200條旋毛蟲肌幼蟲，將感染35 d的小鼠引頸處死，去皮毛、頭、爪、內(nèi)臟，剪碎，加入人工消化液(胃蛋白酶1 g，鹽酸1 mL，蒸餾水100 mL)，置于恒溫磁力加熱攪拌器上37 ℃攪拌2 h，待肌肉被完全消化后過濾，自然沉淀，無菌生理鹽水漂洗3～4次，收集純凈的肌幼蟲。

1.2實驗分組與動物感染

日齡35 d雌性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自鄭州大學實驗動物中心。30只小鼠被隨機分為6組，每組5只。1組：每鼠經(jīng)口感染20條旋毛蟲肌幼蟲，感染13 d剖殺；2組：每鼠經(jīng)口感染20條旋毛蟲肌幼蟲，感染14 d剖殺；3組：每鼠經(jīng)口感染20條旋毛蟲肌幼蟲，感染18 d剖殺；4組：每鼠經(jīng)口感染100條旋毛蟲肌幼蟲，感染13 d剖殺；5組：每鼠經(jīng)口感染100條旋毛蟲肌幼蟲，感染14 d剖殺；6組：每鼠經(jīng)口感染100條旋毛蟲肌幼蟲，感染18 d剖殺。

1.3標本采集

小鼠引頸處死。用生理鹽水清洗陽性鼠肉, 將血水沖洗干凈，放入4 ℃冰箱2 h，冷卻。取完整膈肌和部分腹肌(10 mm×10 mm)，分別標號后，置于電子天平上稱重，記錄。然后將膈肌和腹肌分別剪開，膈肌剪成2～4小塊，腹肌剪成4～6小塊即可。將剪成小塊的膈肌和腹肌，置于2張載玻片之間, 擠壓后兩端用線扎緊，制成制片，備檢。

1.4成囊前肌幼蟲檢查

同一標本制成的制片首先用鏡檢法檢查并計數(shù)，然后通過染色法將制片染色，對染色后的標本再進行鏡檢并計數(shù)。

1.4.1鏡檢法將制片置于低倍鏡(100)下，按照從上向下，從左向右的順序鏡檢全片并計數(shù)。計算每克膈肌蟲荷和每克腹肌蟲荷。

1.4.2染色法醋酸明礬卡紅染色。固定液、染色液的配制同文獻[5]。

1.4.3實驗過程固定：制片置于固定液中24 h，解線后再固定1 h，流水沖洗5 min，間隔5 min，蒸餾水沖洗5 min。染色與分色：固定后的制片置于染色液中10 h；取出后蒸餾水沖洗至標本不脫色為止(約5 min)。體積分數(shù)2%鹽酸酒精分色液中分色2～10 min(視分色具體情況而定)。脫水、透明與封片：分色后的制片依次放入體積分數(shù)50%、70%、80%、95%、體積分數(shù)100%乙醇中脫水，各30 min，然后在100%乙醇中再脫水一次，30 min。無水乙醇與二甲苯( 比例1∶1) 混合液中透明30 min，純二甲苯30 s。在載玻片上滴2滴中性樹膠，將制片放入，加蓋玻片，平置標本盒內(nèi)，室溫陰干。

將染色后的制片置于高倍鏡(400)下，按照從上向下，從左向右的順序鏡檢并計數(shù)。計算每克膈肌蟲荷和每克腹肌蟲荷。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1鏡檢法鏡檢結果

小鼠感染后，1組、2組、4組、5組小鼠膈肌、腹肌壓片鏡檢，均未檢出幼蟲，3組膈肌、腹肌檢出率分別為60%、40%，膈肌與腹肌每克蟲荷均數(shù)差異無顯著性(膈與腹鏡檢q3=0.87，P>0.05)；6組膈肌、腹肌檢出率均為100%，二者每克蟲荷均數(shù)差異無顯著性(膈與腹鏡檢q6=2.75，P>0.05)。見表1。旋毛蟲感染18 d未染色標本，見圖1。

表1　感染旋毛蟲13、14、18 d各組小鼠檢查結果

圖1　旋毛蟲感染未染色標本A. 小鼠膈肌感染18 d(400)；B.小鼠膈肌感染18 d(100)

2.2染色法鏡檢結果

1組未檢出幼蟲；2組膈肌、腹肌檢出率分別為60%、40%，二者每克蟲荷均數(shù)差異無顯著性(膈與腹染色q2=0.18，P>0.05)；3組膈肌、腹肌檢出率均為100%，二者每克蟲荷均數(shù)差異有顯著性(膈與腹染色q3=3.42，P<0.05)；4組膈肌、腹肌檢出率均為80%，二者每克蟲荷均數(shù)差異無顯著性(膈與腹染色q4=0.23，P>0.05)；5組膈肌、腹肌檢出率分別為100%、80%，二者每克蟲荷均數(shù)差異無顯著性(膈與腹染色q5=0.81，P>0.05)；6組膈肌、腹肌檢出率均為100%，二者每克蟲荷均數(shù)差異有非常顯著性(膈與腹染色q6=7.63，P< 0.01)。見表1。旋毛蟲感染13 d、14 d、18 d染色標本，見圖2。

圖2　旋毛蟲感染染色標本A.小鼠腹肌感染13 d(100)；B.小鼠腹肌感染13 d(400)C.小鼠腹肌感染14 d(100)；D.小鼠腹肌感染14 d(400)E.小鼠膈肌感染18 d(100)；F.小鼠膈肌感染18 d(400)

2.3鏡檢法與染色法結果比較

鏡檢與染色兩種方法，3組膈肌每克蟲荷均數(shù)差異有非常顯著性(膈肌鏡檢與染色q3=5.24，P<0.01)，腹肌每克蟲荷均數(shù)差異無顯著性(腹鏡檢與染色q3=2.32，P>0.05)； 6組膈肌每克蟲荷均數(shù)差異有非常顯著性(膈肌鏡檢與染色q6=8.90，P<0.01)，腹肌每克蟲荷均數(shù)差異有顯著性(腹肌鏡檢與染色q6=4.17，P<0.05)。見表1。

3討論

本文實驗結果顯示，鏡檢法小鼠感染13～14d 的4個組(1組、2組、4組、5組)均未檢到蟲體。結合檢查時鏡下觀察情況分析，原因可能為，旋毛蟲感染13～14 d，蟲體太小，無成囊結構，特征不典型，且與肌纖維沒有明顯區(qū)別， 低倍鏡(100)下，難以將幼蟲與周圍組織進行明確辨識。高倍鏡(400)下，雖然放大倍數(shù)增大，但因肌肉中含有水分，清晰度反而不及低倍鏡(100)，也不能正確清晰辨認。以上結果說明，在旋毛蟲感染早期(13 d、14 d)，鏡檢法極易漏檢。染色法①組未檢到蟲體，2組、4組、5組均檢到蟲體。結合檢查時鏡下觀察情況分析，旋毛蟲感染13～14d，染色標本，低倍鏡(100)下，幼蟲入侵的肌纖維染色后色澤一般較深，與相鄰肌纖維有區(qū)別，但內(nèi)部的蟲體形態(tài)不明顯，不易明確判斷是否有幼蟲存在，這時，可將放大倍數(shù)增大，高倍鏡(10×40)下，幼蟲輪廓清晰可見，非常容易判斷是否有幼蟲存在，不易漏檢。需要注意，觀察此類旋毛蟲感染早期的染色標本，低倍鏡(100)尋找，發(fā)現(xiàn)可疑點，高倍鏡(400)鑒別。因為，在標本制作過程中，由于染色、分色等諸多原因，正常肌纖維也會出現(xiàn)有些色澤較淺，有些色澤較深，與相鄰肌纖維難以區(qū)別，若僅在低倍鏡(100)下根據(jù)色澤特點進行判斷，易造成誤判。

小鼠感染18 d 的兩個組(3組、6組)，鏡檢與染色兩種方法，膈肌與腹肌均檢出了幼蟲。結合檢查時鏡下觀察情況分析，旋毛蟲感染18 d，鏡檢法觀察未染色標本， 低倍鏡(100)下，幼蟲所在部位色澤較周圍組織淺、亮，已能看到蟲體大體輪廓，增大放大倍數(shù)(400)，幼蟲與周圍組織可進行明確辨識。旋毛蟲感染18 d，染色法觀察染色標本，低倍鏡(100)下，有的幼蟲的特征已較明顯，高倍鏡(400)下，蟲體形態(tài)非常清晰，極易辨別。3組膈肌蟲荷均數(shù)，染色法顯著高于鏡檢法；6組膈肌蟲荷均數(shù)，染色法顯著高于鏡檢法；腹肌蟲荷均數(shù)，染色法高于鏡檢法。染色法高于鏡檢法的原因，可能是幼蟲進入肌細胞的時間有先后，其形態(tài)發(fā)育存在差別，蟲體較大的幼蟲染色法和鏡檢法均易檢出，而蟲體較小的幼蟲鏡檢法易漏檢。

關于取材部位。2組、4組、5組膈肌、腹肌染色法雖然均檢到蟲體，但因感染早期，蟲體數(shù)量少，統(tǒng)計學處理，膈肌、腹肌蟲荷均數(shù)無差異。3組和6組，雖然感染數(shù)量不同，但感染時間同為18 d。鏡檢法：二組膈肌、腹肌的蟲荷均數(shù)均無差異；染色法：3組膈肌蟲荷均數(shù)高于腹肌蟲荷均數(shù)，6組膈肌蟲荷均數(shù)顯著高于腹肌蟲荷均數(shù)。

對以上結果比較發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲感染早期的病原學檢查結果，與感染數(shù)量、檢查方法和取材部位均有關。感染較重的宿主，其寄生幼蟲在肌細胞中出現(xiàn)時間，早于感染較輕的宿主。 鏡檢法不適合作為旋毛蟲感染早期的病原學檢查方法，而染色法適合作為旋毛蟲感染早期的病原學檢查方法。取材部位對檢查結果有很大影響，從膈肌取材，檢出肌幼蟲的陽性率高于腹肌[6]。

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[責任編輯時 紅]

Comparison of trichinelloscopy and Staining method for the inspection results of Trichinella spiralis pre-encapsulated larvae

1. Medical College, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 2. Minsheng College, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

Abstract:〔Objective〕To observe the inspection results of trichinelloscopy and staining method for on Trichinella spiralis pre-encapsulated larvae (PEL). 〔Methods〕Thirty male Kunming mice were randomly divided into six test groups (with 5 mice per group). Test group No.1: each mouse was inoculated orally with 20 muscle larvae of Trichinella spiralis and was killed after being infected for 13 days. Test group No.2: each mouse was inoculated orally with 20 muscle larvae of Trichinella spiralis and was killed after being infected for 14 days. Test group No.3: each mouse was inoculated orally with 20 muscle larvae of Trichinella spiralis and was killed after being infected for 18 days. Test group No.4: each mouse was inoculated orally with 100 muscle larvae of Trichinella spiralis and was killed after being infected for 13 days. Test group No.5: each mouse was inoculated orally with 100 muscle larvae of Trichinella spiralis and was killed after being infected for 14 days. Test group No.6: each mouse was inoculated orally with 100 muscle larvae of Trichinella spiralis and was killed after being infected for 18 days. Trichinelloscopy and Staining method were used to inspect the Trichinella spiralis pre-encapsulated larvae in the diaphragm and abdominal muscle. 〔Results〕Results got through Trichinelloscopy: Test group No.1, 2, 4, 5 were not found any PEL; for test group No.3 the PEL rates in the diaphragm and abdominal muscle were 60% and 40% respectively; and the PEL rates both in the diaphragm and abdominal muscle for test group No.6 were 100%. Results got through staining method: Test group No.1were not found any PEL; as for test group No.2, 3, 4, 5, 6, the PEL rates in the diaphragm were 60%, 100%, 80%,100% and 100% respectively and the PEL rates in the abdominal muscle were 40%, 100%, 80%, 80% and 100% respectively.As for test group No.3, the mean worm burden per gram for PEL in the diaphragm was higher than the number of PEL in the abdominal muscle (q3 = 3.42, P<0.05). And for test group No.6, the mean worm burden per gram for PEL in the diaphragm was obviously higher than the number of PEL in the abdominal muscle (q6 = 7.63, P<0.01). In terms of the mean worm burden of PEL in the diaphragm in test group No.3 and No.6, staining method was much more efficient than Trichinelloscopy (q3=5.24, q6=8.90, P<0.01). Besides, as for the the mean worm burden of PEL in the abdominal muscle in test group No.6, staining method was still obvious than Trichinelloscopy (q6 = 4.17， P<0.05).〔Conclusion〕The inspecting results of Trichinella spiralis pre-encapsulated larvae (PEL) is related to the infected degree, inspecting method and also body parts being inspected. For the heavily infected host, the PEL appear earlier than in the lightly infected host. What's more, staining method is more efficient than Trichinelloscopy and inspecting the diaphragm is more efficient than inspectining the abdominal muscle.

Key words:trichinella spiralis; pre-encapsulated larvae (PEL); trichinelloscopy; staining method; inspection

中圖分類號：R383.15

文獻標志碼：A

作者簡介：樊航(1994-)，男，河南長垣，本科在讀，從事基礎醫(yī)學的研究和學習。 通信作者：王國英(1962-)，女，山西運城人，高級實驗師，從事寄生蟲免疫及寄生蟲流行病學的教學與科研工作。

基金項目：2014年度河南大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(14NA020)；河南大學教學改革研究項目(2015133)

收稿日期：2015-10-30

文章編號：1672-7606(2016)01-0032-04