陳麗艷，王天龍，王　萍，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥所，哈爾濱 150036)

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·方藥研究·

黃瓜籽蛋白提取工藝及性質(zhì)研究

陳麗艷，王天龍，王萍，王偉明*

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥所，哈爾濱 150036)

摘要：目的確定黃瓜籽蛋白最佳提取工藝，并對(duì)蛋白等電點(diǎn)及分子量進(jìn)行考察。方法采用鹽溶法通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行提取工藝考察，通過(guò)測(cè)定最低溶解度的pH值確定蛋白等電點(diǎn)、硫酸銨分級(jí)沉淀及膜透析除鹽得到黃瓜籽蛋白，并利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白分子量。結(jié)果黃瓜籽蛋白最佳提取工藝為NaCl溶液濃度0.14 mol/L、料液比1∶3、提取溫度4 ℃、pH值5、浸提時(shí)間8 h、提取次數(shù)為3 次，經(jīng)計(jì)算生藥黃瓜籽中蛋白含量為3.04%，硫酸銨沉淀飽和度為55%，等電點(diǎn)為3.8，蛋白分子量分布于35 KD以下。結(jié)論本法確定了黃瓜籽蛋白的最佳提取工藝及性質(zhì)，為蛋白的進(jìn)一步分離、純化及活性研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃瓜籽；蛋白質(zhì)；提取工藝；等電點(diǎn)；分子量

黃瓜籽為葫蘆科植物黃瓜(CucumbersativusL.)的干燥成熟種子?！吨腥A本草》中記載其具有續(xù)筋接骨、祛風(fēng)、消痰的功效，主治骨折筋傷、風(fēng)濕痹痛、老年痰喘[1]。黃瓜籽中含有皂苷、氨基酸、糖類、植物甾醇、三萜類、揮發(fā)油等化學(xué)成分[2]，而對(duì)其蛋白質(zhì)的研究尚不足。植物種子一般含有豐富的蛋白質(zhì)，且具有廣泛的生物活性，如大豆蛋白、南瓜籽蛋白等對(duì)人體多種疾病有預(yù)防和治療作用[3-4]。從植物中提取蛋白質(zhì)的方法有多種，其中鹽溶法有利于保持蛋白的活性和穩(wěn)定性[5-6]。本研究利用鹽溶法提取黃瓜籽蛋白，通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝，并測(cè)定蛋白等電點(diǎn)、分析硫酸銨分級(jí)沉淀飽和度，并通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛋白分子量分布，為黃瓜籽蛋白進(jìn)一步分離、純化及活性研究奠定基礎(chǔ)。

1材料

1.1儀器UV-2550 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；KE.WEI 型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永新實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)；AF-20A型密封型搖擺式中藥粉碎機(jī)(溫嶺市奧利中藥機(jī)械有限公司)；98-1-C型數(shù)字控溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；YP2001N型、YP20KN型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；透析袋 3.5 KD截留量 27 mm(美國(guó))；X85-2恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦)；DYY-12型電泳儀(北京市六一儀器廠)；BCD-225SLDA智能控溫電冰箱(海爾)。

1.2試藥黃瓜籽購(gòu)于安國(guó)市奉義中藥飲片有限公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明教授鑒定為葫蘆科甜瓜屬植物黃瓜(CucumissativusL.)的干燥成熟種子，使用前烘干并粉碎成粗粉。

2方法

2.1黃瓜籽脫脂粉的制備黃瓜籽粗粉按料液比1∶3(M/V)加入石油醚(60～90 ℃)攪拌后于4 ℃浸提12 h,濾過(guò)，回收石油醚，藥渣通風(fēng)干燥即得黃瓜籽脫脂粉,100 g黃瓜籽脫脂后得到73.4 g脫脂粉。

2.2黃瓜籽蛋白提取工藝研究采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法，以相同質(zhì)量脫脂黃瓜籽粉的蛋白含量為指標(biāo)進(jìn)行考察。為了保持蛋白活性，采用4 ℃低溫提取，前期通過(guò)單因素考察得到Nacl濃度為0.14 mol/L、料液比1∶3較適宜，因此本研究?jī)H對(duì)影響蛋白提取的關(guān)鍵因素pH值、浸提次數(shù)和浸提時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考察[7]，因素水平設(shè)置如表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表

2.3黃瓜籽蛋白的含量測(cè)定采用Bradford法[8](考馬斯亮藍(lán)可溶性蛋白微量測(cè)定法)進(jìn)行測(cè)定。

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的制備精密稱取牛血清蛋白(BSA)10 mg，加生理鹽水定容至10 mL，配成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

2.3.2考馬斯亮藍(lán)G-250的配制[9]稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%的磷酸溶液100 mL，用蒸餾水定容至1L,溶解后過(guò)濾，保存至棕色瓶?jī)?nèi)。

2.3.3蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取7個(gè)試管，按順序分別加入0、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，每個(gè)試管補(bǔ)充蒸餾水至0.2 mL，每管各加入G-250溶液10 mL，搖勻，于595 nm處測(cè)定吸光度值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量(mg)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3.441 4X+0.008 4(r=0.991 6)，表明蛋白質(zhì)在0.02～0.2 g/L呈良好線性關(guān)系。

2.3.4樣品的測(cè)定取樣品溶液0.2 mL同法測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

2.4蛋白等電點(diǎn)(pI)的測(cè)定[10]蛋白在一定溶劑中溶解度最低時(shí)的pH值即為蛋白等電點(diǎn)。按表4向每個(gè)試管內(nèi)精密加入相應(yīng)試劑，混勻，靜置20 min，觀察每支試管內(nèi)溶液的混濁度，以-、+、++、+++、++++符號(hào)表示沉淀的多少確定蛋白的pI。

2.5硫酸銨分級(jí)沉淀黃瓜籽蛋白[11]

2.5.1硫酸銨分級(jí)鹽析方法 稱取50 g脫脂黃瓜籽粉,根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行提取，得到蛋白提取液，準(zhǔn)確量取50 mL，用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至pI。進(jìn)行鹽析時(shí)，先將硫酸銨磨成粉末，按照所需飽和度的要求，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨達(dá)到一定飽和度(30%、45%、55%、65%、75%、90%)。整個(gè)鹽析過(guò)程中保持在4 ℃。鹽析后放置1 h，待沉淀完全后離心過(guò)濾，將各段沉淀分別用0.14 mol/L NaCl溶液復(fù)溶至25 mL，同法測(cè)定各段沉淀的蛋白含量。

2.5.2蛋白質(zhì)的脫鹽[12]將硫酸銨沉淀得到的蛋白質(zhì)溶液裝入截留分子量為3.5 KD的透析袋，置于水中透析除鹽，經(jīng)常換水，并以10% BaCl2溶液檢測(cè)脫鹽是否徹底。為了防止微生物污染和蛋白質(zhì)變性，透析應(yīng)在低溫環(huán)境下(4 ℃)進(jìn)行。

2.6黃瓜籽蛋白分子量分布[13]采用SDS-PAGE凝膠電泳與標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)比評(píng)估黃瓜籽蛋白的分子量分布。

3結(jié)果

3.1正交試驗(yàn)結(jié)果正交試驗(yàn)結(jié)果、方差分析見(jiàn)表2和表3，由極差分析和方差分析可知，3個(gè)因素對(duì)蛋白提取率的影響順序?yàn)锽>A>C，其中B因素影響最顯著(P<0.05)。最終確定黃瓜籽蛋白最佳提取工藝為A1B3C3，即pH值為5，浸提次數(shù)為3次，浸提時(shí)間8 h，提取的蛋白含量最高，經(jīng)驗(yàn)證該工藝得到脫脂黃瓜籽粉蛋白含量為4.14%，折算成生藥量蛋白含量為3.04%。

表2　黃瓜籽蛋白提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　正交設(shè)計(jì)方差分析

3.2蛋白等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果蛋白等電點(diǎn)結(jié)果顯示，當(dāng)pH=5.6時(shí)，溶液開(kāi)始出現(xiàn)渾濁，pH=3.8時(shí)沉淀最多，隨著pH降低沉淀減少，可初步確定黃瓜籽蛋白的等電點(diǎn)為3.8。見(jiàn)表4。

3.3硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)果硫酸銨飽和度為30%時(shí)黃瓜籽蛋白開(kāi)始析出，當(dāng)飽和度達(dá)到55%時(shí)生成的沉淀蛋白含量最高。由結(jié)果可知,當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到55%～65%時(shí),蛋白析出可達(dá)到50%以上。

3.4SDS-PAGE結(jié)果經(jīng)Quantity one軟件分析,黃瓜籽蛋白分子量在35 KD以下,其中分子量在14.4 KD以下的蛋白分布較密集。

表4　蛋白等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

4討論

黃瓜籽功效及安全性被人們普遍認(rèn)可并廣泛應(yīng)用于骨折后愈合及骨質(zhì)疏松的預(yù)防和輔助治療。一些學(xué)者[2,14-16]針對(duì)黃瓜籽化學(xué)成分、功能評(píng)價(jià)及藥理作用等進(jìn)行了相應(yīng)的研究，但對(duì)其蛋白類成分的研究尚不充分。蛋白質(zhì)是一類重要的高分子化合物，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致物理和化學(xué)性質(zhì)的不穩(wěn)定，因此在提取過(guò)程中要綜合考慮各因素的影響。為了保持蛋白活性采用低溫浸提的方法，通過(guò)正交試驗(yàn)得到了黃瓜籽蛋白最佳提取工藝，其中浸提次數(shù)對(duì)蛋白提取影響最顯著，提取次數(shù)過(guò)少，蛋白不能充分溶解釋放到溶劑中致使蛋白含量較低；pH值是影響蛋白質(zhì)提取及保持活性的一個(gè)重要因素，在中性偏酸性條件下更利于保持蛋白質(zhì)的生物活性；浸提時(shí)間過(guò)短蛋白提取不充分，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致蛋白分解，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證8 h最適宜。確定了黃瓜籽蛋白的等電點(diǎn)及硫酸銨分級(jí)沉淀的適宜飽和度，為蛋白的精制奠定基礎(chǔ)。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)在不同pH條件下溶解度不同，只有當(dāng)溶液pH接近等電點(diǎn)時(shí)，大部分蛋白才能為飽和硫酸銨沉淀出來(lái)，因此鹽析時(shí)常選擇溶液pH值在該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳確定了黃瓜籽蛋白分子量為小分子蛋白，據(jù)報(bào)道[17]，小分子蛋白通常具有較好的生物活性，更利于人體的吸收和利用。蔡偉明等[18]研究了黃瓜籽多肽的抗骨質(zhì)疏松作用，證實(shí)了黃瓜籽小分子蛋白的活性，然而對(duì)多肽或蛋白的提取工藝及分子量尚未提及，本實(shí)驗(yàn)確定了黃瓜籽蛋白的最優(yōu)提取工藝及性質(zhì)，為黃瓜籽蛋白進(jìn)一步分離純化及相應(yīng)的活性研究奠定了基礎(chǔ)。

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Extraction technology and characteristics of seed protein of Cucumber sativus L.

CHEN Liyan,WANG Tianlong,WANG Ping,WANG Weiming*

(Heilongjiang Traditional Medical Academy of Sciences,Harbin 150036,China)

Abstract：ObjectiveDtermine the optimal extraction technology,isoelectric point and molecular weight of cucumber seed protein.MethodsThe cucumber seed protein was extracted by salt-dissolution and L9(34)orthogonal test was used to determine the optimal extraction technology,pH at lowest solubility of protein was isoelectric point,Ammonium sulfate precipitate and Membrane dialysis were applied to obtain crude protein,and molecular weight of the protein was detected by polyacrylamide gel electrophoresis.ResultsThe optimal extraction technology of cucumber seed protein was:The concentration of sodium chloride was 0.14 mol/L,the ratio of solid and liquid was 1:3,the extraction temperature was 4 ℃,the pH value was 5,the extraction time was 8 h,the extraction times were three times,the protein content was 3.04%.SDS-PAGE result showed that the molecular weight of crude protein was under 35 KD.ConclusionThis experiment determined the best extraction technology and characteristics of cucumber seed protein,and laid the foundation for the further purification and activity research of it.

Keywords：cucumber seed;protein;extraction technology;isoelectric point;molecular weight

(收稿日期:2015-06-30)

文章編號(hào)：2095-6258(2016)02-0253-04

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

*通信作者：王偉明，博士，研究員，電話-(0451)55665478,電子信箱-1442540238@qq.com

作者簡(jiǎn)介：陳麗艷(1971-)，女，碩士，副研究員，主要從事中藥新藥及保健食品的研究與開(kāi)發(fā)。

基金項(xiàng)目：黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目(GA12C102)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.011