張巖明　戎秀格　李廣平

[摘 要] 目的：探討小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）介導(dǎo)的FOXA2基因沉默對(duì)乙肝病毒（HBV）復(fù)制的影響。方法：設(shè)計(jì)靶向FOXA2基因siRNA序列，構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HuH-7人肝癌細(xì)胞。用QT-PCR和 RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞FOXA2基因mRNA變化；用Western blot檢測(cè)細(xì)胞FOXA2蛋白變化；用Northern blot分析FOXA2基因沉默后HBV RNA表達(dá)。結(jié)果：構(gòu)建FOXA2基因穩(wěn)定沉默的F-S細(xì)胞株，F(xiàn)OXA2基因與蛋白沉降效率明顯。FOXA2基因沉默后，HBV病毒3.5kbRNA升高，F(xiàn)OXA2抑制HBV病毒的復(fù)制。結(jié)論：FOXA2基因通過(guò)降低3.5kbRNA的表達(dá)抑制乙肝病毒的復(fù)制。

[關(guān)鍵詞] siRNA；FOXA2；乙肝病毒

中圖分類號(hào)：R575.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2016）02-052-03

DOI：10.11876/mimt201602019

乙肝病毒（HBV）引起的傳染性疾病。HBV是雙鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)[1]，3.5kbRNA包含C（核抗原）/P（DNA多聚酶）/S（表面抗原）/X（X蛋白），是HBV進(jìn)行復(fù)制的關(guān)鍵因子。FOXA[2-3]是核轉(zhuǎn)錄因子，由FOXA1、FOXA2、FOXA3構(gòu)成。FOXA是肝轉(zhuǎn)錄因子之一，在肝器官的形成和發(fā)展及肝進(jìn)行新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。FOXA也是HBV復(fù)制的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，因?yàn)镠BV病毒所有的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子均包含F(xiàn)OXA結(jié)合位點(diǎn)。大量實(shí)驗(yàn)表明HBV轉(zhuǎn)基因鼠中轉(zhuǎn)入FOXA2，HBV復(fù)制降低，進(jìn)而推斷FOXA2可以抑制HBV的復(fù)制。因此我們?cè)O(shè)計(jì)靶向FOXA2的siRNA序列，構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HuH-7，觀察FOXA2基因沉默后對(duì)乙肝病毒復(fù)制的影響。

1 材料

質(zhì)粒載體（上海吉?jiǎng)P基因公司）；jetPRIME Transfection Reagent （Polyplus ）；Trizol（Invitrogen）；核酸提取試劑盒（莊盟國(guó)際生物基因公司）；Maxima SYBR Green QT-PCR Master Mixes（Thermo Fisher Scientific company）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit （北京康為世紀(jì)生物公司）；Golden view（莊盟國(guó)際生物基因公司）；β-Actin單克隆抗體（Cell Signaling company ）；FOXA2抗體（Abcam company）；miRNA Northern blot reagent （TAKARA company）；ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher Scientific company ）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HuH-7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2 條件下孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。EDTA胰酶消化HuH-7細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選

將1.5×105 HuH-7細(xì)胞接種于6孔板中，37℃、5% CO2 孵育箱中過(guò)夜。待HuH-7細(xì)胞貼壁覆蓋率70%～80%時(shí)，換新培養(yǎng)液，將含F(xiàn)OXA2-siRNA的質(zhì)粒與jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑按1：2混合滴加到6孔板1、2、3孔細(xì)胞上。同時(shí)將不含靶序列空質(zhì)粒與jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑按照同樣比例滴加到6孔板4、5孔細(xì)胞上。第6孔為陰性對(duì)照只加培養(yǎng)液（陰性組）。轉(zhuǎn)染3周后挑取單克隆進(jìn)行鑒定。將FOXA2基因沉默細(xì)胞株命名為F-S細(xì)胞株；空質(zhì)粒細(xì)胞株命名為K-S細(xì)胞株。提取F-S細(xì)胞株、K-S細(xì)胞株、HuH-7細(xì)胞基因和蛋白，用QT-PCR、RT-PCR及Western blot對(duì)siRNA介導(dǎo)FOXA2基因沉默進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 QT-PCR、RT-PCR 法檢測(cè)FOXA2基因mRNA

表達(dá)

用Trizol試劑1mL分別裂解F-S細(xì)胞株、K-S細(xì)胞株、HuH-7細(xì)胞株；加入0.2mL氯仿，顛倒混勻待兩液相分層后離心，取上清液至新EP管中；加與上清液等體積異丙醇混勻，室溫放置20min，離心棄上清；加入無(wú)水乙醇離心棄上清液并風(fēng)干；加入30μL RNAase-free ddH2O，反復(fù)吹打混勻，獲得細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)體系得到cDNA。QT-PCR條件：底物液12μL，H2O7.5μL，引物（FOXA2、Actin）2μL，模板2μL。RT-PCR對(duì)FOXA2基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，條件如下：98℃ 10s，60℃30s，72℃30s，32個(gè)循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像儀顯示，以ActinPCR擴(kuò)增作為內(nèi)參對(duì)照。

2.4 Western blot檢測(cè)FOXA2蛋白變化

用蛋白抽提試劑分別提取F-S細(xì)胞株、K-S細(xì)胞株、HuH-7細(xì)胞株總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，用Western blot檢測(cè)FOXA2蛋白表達(dá)。具體步驟：配置分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE 80V電泳3h后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶封閉，抗FOXA2抗體（1：500）4℃過(guò)夜，二抗（1：2000）37℃孵育1h，ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光后曝光成像，同時(shí)檢測(cè)Actin（1：500）表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照。

2.5 Northern blot 檢測(cè) HBV RNA 表達(dá)

用 Trizol 法分別提取F-S細(xì)胞株、K-S細(xì)胞株、HuH-7細(xì)胞RNA。電泳：配置15%尿素變性PAGE膠，將樣品與RNA loading按比例混合，70℃5min，立即置于冰上，上樣恒壓80V電泳；轉(zhuǎn)膜：組裝轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)濾紙、膠、膜、濾紙，恒壓60V轉(zhuǎn)膜1h；雜交：將膜放入雜交管中，加入雜交緩沖液42℃旋轉(zhuǎn)震蕩30min ，棄液加入雜交緩沖液+mRNA探針42℃旋轉(zhuǎn)震蕩30min，棄液加入雜交緩沖液+探針信號(hào)擴(kuò)增素42℃旋轉(zhuǎn)震蕩2h；信號(hào)檢測(cè)：將膜放入顯色盒中，封閉30min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素40min，加入化學(xué)試劑曝光成像。

3 結(jié)果

3.1 F-S細(xì)胞株 FOXA2基因mRNA水平變化

3.1.1 QT-PCR法檢測(cè)F-S細(xì)胞株沉默效率 圖1a為FOXA2基因在F-S細(xì)胞株、K-S細(xì)胞株、HuH-7細(xì)胞中定量表達(dá)。對(duì)比HuH-7細(xì)胞與K-S細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，空質(zhì)?；?qū)Τ聊视绊懖淮?，表明其在基因水平?duì)沉默效率影響不顯著，而F-S細(xì)胞FOXA2基因沉默效率為89%，與K-S細(xì)胞相比有顯著性差異（P<0.05）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證沉默細(xì)胞株穩(wěn)定性，我們將F-S細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，每隔3d收集細(xì)胞，提取總RNA，用QT-PCR法檢測(cè)F-S細(xì)胞FOXA2基因表達(dá)。由圖1b得知，經(jīng)過(guò)15次傳代，F(xiàn)-S細(xì)胞FOXA2基因沉默效率在80%～93%之間波動(dòng)（P<0.05），顯示其沉默效果穩(wěn)定。

3.1.2 RT-PCR法檢測(cè)F-S細(xì)胞株FOXA2基因表達(dá) 將F-S細(xì)胞株、K-S細(xì)胞株、HuH-7細(xì)胞株分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)FOXA2基因表達(dá)。與HuH-7細(xì)胞相比，F(xiàn)-S細(xì)胞中FOXA2基因表達(dá)明顯降低（見(jiàn)圖2）。

3.2 Western blot 檢測(cè)F-S細(xì)胞株FOXA2蛋白水平變化

3.3 Northern blot 檢測(cè) HBV RNA 表達(dá)情況

4 討論

慢性乙型肝炎[4-5]是我國(guó)最常見(jiàn)傳染病之一。1992年中國(guó)乙型肝炎表面抗原（HBeAg）攜帶者為9.75%，因此中國(guó)屬于乙肝病毒高流行區(qū)。自從2002年乙肝疫苗納入計(jì)劃免疫以來(lái)，乙肝感染率已下降為7.18%，與1992年相比，乙肝感染者已減少3000萬(wàn)。然而乙肝病毒攜帶者，尤其是在幼年[6]感染乙肝病毒患者，30%左右會(huì)發(fā)展成為慢性乙肝，甚至是肝硬化或者肝癌。因此研究乙型肝炎分子機(jī)制變得尤為重要。

siRNA[7]作為一種新基因阻斷技術(shù)，具有高效、特異、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，目前已用于自身免疫性疾病、病毒感染、乙型肝炎 、癌癥等多種疾病研究中。在體外合成雙鏈RNA（doubles stranded RNA，dsRNA）由質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，核酸酶Ⅲ-Dier將其處理為21～23個(gè)堿基小干擾RNA（small interferencing RNA，siRNA）。siRNA與解螺旋酶、核酸酶等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA inducing silencing complex，RISC），然后與靶基因互補(bǔ)mRNA結(jié)合，將mRNA降解。

本次實(shí)驗(yàn)我們用siRNA技術(shù)在HuH-7細(xì)胞中誘導(dǎo)FOXA2[8-10]基因沉默。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，F(xiàn)OXA2基因在mRNA水平和蛋白水平都有明顯下降。多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果均是FOXA2基因和蛋白明顯下降，從而證明siRNA能有效阻斷FOXA2基因表達(dá)。在利用QT-PCR對(duì)FOXA2基因沉默效率連續(xù)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)FOXA2基因沉默效率在80%～93%范圍波動(dòng)，沒(méi)有明顯沉默效率丟失，這說(shuō)明我們建立F-S細(xì)胞株比較穩(wěn)定。

大量資料研究證實(shí)，HBV所有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子均包含F(xiàn)OXA[11-13]結(jié)合位點(diǎn)。從實(shí)驗(yàn)中我們也可以觀察到，3.5kbRNA 在HuH-7細(xì)胞中表達(dá)量低，在FOXA2基因沉默F(xiàn)-S細(xì)胞中表達(dá)量增加。3.5Kb[14] RNA 包含precore RNA 和pgRNA。Precore RNA 編碼HBeAg，pgRNA編碼聚合酶，同時(shí)也是HBV 病毒DNA模板，是HBV復(fù)制關(guān)鍵基因。FOXA2可以降低pgRNA表達(dá)，從而抑制HBV復(fù)制。大量資料表明，在非肝來(lái)源細(xì)胞中，F(xiàn)OXA2可以通過(guò)誘導(dǎo)核激素受體，從而抑制HBV病毒復(fù)制。也有報(bào)道指出FOXA2可直接阻斷pgRNA延伸。這些結(jié)果都證實(shí)FOXA2具有負(fù)性調(diào)節(jié)HBV病毒復(fù)制功能，與本實(shí)驗(yàn)觀點(diǎn)相符。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FOXA2基因通過(guò)降低3.5kbRNA的表達(dá)抑制乙肝病毒的復(fù)制，深入研究FOXA家族，尤其是對(duì)FOXA2基因進(jìn)一步探索，可以為乙型肝炎分子治療[15-16]奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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