張雪亮

（浙江順風(fēng)海德爾有限公司，浙江金華322100）

低色素高產(chǎn)普魯蘭多糖生產(chǎn)菌株的篩選

張雪亮

（浙江順風(fēng)海德爾有限公司，浙江金華322100）

本研究對(duì)短梗霉3.4580菌株用紫外線照射處理，獲得變異菌種PL052的糖耐受濃度提高到15%，多糖最高產(chǎn)量在108g/L，且發(fā)酵液無(wú)色素或色素淡化。通過(guò)對(duì)變異菌種PL052進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該菌株遺傳穩(wěn)定，可望應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)中。

普魯蘭多糖；紫外線；低色素；高產(chǎn)

普魯蘭多糖（Pullulan），是出芽短梗霉屬（Aureobasidium pullulans）的微生物利用糖質(zhì)原料發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖，因此又名短梗霉多糖。該多糖易溶于水，無(wú)毒、無(wú)味，可食用；具有優(yōu)良的可塑性、成膜性，其制成的薄膜隔氣性好，在自然界可被微生物降解，不會(huì)引發(fā)環(huán)境污染，故被譽(yù)為無(wú)公害塑料。由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和生物特性，使其在應(yīng)用中具有其他產(chǎn)品無(wú)法替代的優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品、化妝品和農(nóng)藥等行業(yè)具有廣泛的用途。

2006年5月19日，國(guó)家衛(wèi)生部發(fā)布了第8號(hào)公告，普魯蘭多糖為新增4種食品添加劑產(chǎn)品之一，國(guó)內(nèi)企業(yè)紛紛介入。尤其2012年毒膠囊事件的爆發(fā)，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)動(dòng)物性來(lái)源的原料擔(dān)憂，普魯蘭多糖替代明膠做膠囊成了一個(gè)首選。但現(xiàn)有普魯蘭多糖菌種產(chǎn)率低，且出芽短梗霉會(huì)分泌黑色素，這種物質(zhì)會(huì)牢固地粘附在普魯蘭多糖上，很難用一般方法除去，限制了普魯蘭多糖的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

本研究現(xiàn)通過(guò)對(duì)短梗霉3.4580菌株用紫外線照射處理，獲得一株產(chǎn)色素少且糖的產(chǎn)量較高的突變株，為下一步工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

出芽短梗霉3.4580，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

①斜面，麥芽汁瓊脂；②種子培養(yǎng)基[蔗糖5%，酵母膏0.25%，（NH4）2SO40.05%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 0.1%]，pH 6.0，121℃，滅菌30min；③發(fā)酵培養(yǎng)基[蔗糖15%，酵母膏0.3%，（NH4）2SO40.05%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 0.1%]，pH 6.0，121℃，滅菌30min。

1.3 培養(yǎng)方法

①斜面培養(yǎng)，保溫箱28～30℃，培養(yǎng)72h；②種子培養(yǎng)條件，250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基50mL，接斜面種子一環(huán)，28～30℃ 220rpm搖床培養(yǎng)24h；③發(fā)酵培養(yǎng)條件，250mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50mL，接種量為5%，28～30℃ 280rpm搖床培養(yǎng)3d。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定

量取發(fā)酵液，1萬(wàn)rpm離心30min，上清液倒出測(cè)定多糖含量，沉淀的菌體用蒸餾水洗滌3遍后，在105℃烘干后稱重。以細(xì)胞干重表示細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.5 發(fā)酵液粗多糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取上述測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)的上清液，加入2倍體積的乙醇，充分混合均勻，再靜置5min左右沉淀多糖。4 000rpm離心10min，小心傾出上清液，得多糖沉淀，用乙醇洗滌3次，70℃干燥至恒重，即為普魯蘭多糖粗品，稱重計(jì)算產(chǎn)量。

1.6 孢子懸浮液的制備

將斜面菌種轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，28℃ 220rpm活化24h，再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)12～16h，達(dá)到對(duì)數(shù)期，鏡檢涂片分布大量酵母狀孢子時(shí)，放入裝有玻璃珠的三角瓶劇烈振蕩10～15min，打碎孢子團(tuán)快，用脫脂棉過(guò)濾。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整孢子濃度到約106個(gè)/mL。

1.7 誘變處理

取上述懸浮液5mL于平板上，將平板置于紫外燈下30cm處，打開紫外燈，各平板分別照射不同時(shí)間后，放入30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，檢測(cè)紫外線照射處理的致死率，將長(zhǎng)出的菌落移接于麥芽汁固體斜面上。待斜面培養(yǎng)成熟后，轉(zhuǎn)接入三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵檢測(cè)多糖產(chǎn)量，篩選高產(chǎn)菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變結(jié)果

出芽短梗霉菌株具有復(fù)雜的生活周期，在其生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)常有如下5種變化：酵母狀、芽孢子、腫脹孢子、菌絲體和厚垣孢子。一般取酵母狀孢子對(duì)紫外線較敏感。在實(shí)際試驗(yàn)中，通常采用照射距離為30cm。3.4580菌株按上述方法制備孢子懸浮液，用30W紫外燈照射后，各平板共挑選出突變株168株，經(jīng)篩選有16個(gè)株多糖產(chǎn)量有不同程度的提高。檢測(cè)致死率和正突變率列于表1。表1結(jié)果顯示，照射時(shí)間越長(zhǎng)，致死率越高；照射時(shí)間對(duì)正突變率的影響沒有明顯的規(guī)律。

表1 紫外線照射誘變的結(jié)果

2.2 出發(fā)菌株和變異菌株的菌落特征比較

菌落特征反映了菌株的性能，菌落大小體現(xiàn)了菌體繁殖速度與多糖產(chǎn)量的高低，以大者為優(yōu)。發(fā)酵液顏色與菌落顏色基本一致，菌落顏色淺，發(fā)酵液顏色也淺，以乳白色為優(yōu)。采用觀察菌落特征的方法篩選多糖產(chǎn)量高而色素低的優(yōu)良菌株，大大簡(jiǎn)化了菌種篩選的步驟，縮短了篩選時(shí)間。

出發(fā)菌株3.4580在麥芽汁固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48h后，菌落中央開始出現(xiàn)黑色絨毛狀菌絲，搖瓶培養(yǎng)也在同一時(shí)間培養(yǎng)液變成綠黑色；而誘變而來(lái)的菌株P(guān)L052在麥芽汁固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)6～7d后才產(chǎn)生灰黑色孢子，搖瓶培養(yǎng)中都末見有黑色素出現(xiàn)，PL052在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵液一直呈現(xiàn)黃白色。出發(fā)菌株3.4580的糖耐受濃度只有5%，多糖產(chǎn)量只有10～20g/L,而PL052的糖耐受濃度大大提高，初始糖濃度可達(dá)15%，多糖產(chǎn)量100g/L左右，生產(chǎn)效率提高明顯。與出發(fā)菌株3.4580相比，突變菌株P(guān)L052的菌落明顯大于出發(fā)菌種。

2.3 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

將誘變菌株P(guān)L052連續(xù)傳代培養(yǎng)，共20代，取第5、10、15、18和20代作搖瓶多糖發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果誘變菌株P(guān)L052的發(fā)酵液最終顏色為黃白色，多糖產(chǎn)量維持在83～108g/L，最高產(chǎn)量為108g/L。由此可見，誘變菌株P(guān)L052是穩(wěn)定的。

3 結(jié)論

出發(fā)菌株3.4580的多糖產(chǎn)量在10～20g/L，糖耐受濃度為5%，通過(guò)紫外線誘變，獲得的變異菌株P(guān)L052的糖耐受濃度提高到15%，多糖產(chǎn)量穩(wěn)定在83～108g/L，且無(wú)色素或色素淡化，說(shuō)明誘變效果顯著，多糖生產(chǎn)效率提高幅度較大。誘變菌株P(guān)L052經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)果顯示，該菌株遺傳穩(wěn)定，具有在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用的潛力。

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Screening of Low Pigment and High Producing Pullulan Production Strain

Zhang Xue liang
(Zhejiang Shunfeng Haider Limited Company,Zhejiang Jinhua322100)

Ultraviolet irradiation treatment of A ureobasidium pullulans 3.4580 strain,A mutants strain PL052 was obtained,which the sucrose tolerance concentration was increased to 15%,The highest producing of pullulan was 108g/L,and the fermentation solution had no pigment or hypopigmentation.Through the genetic stability test of the mutant strain PL052,The results showed that the genetic stability of the strain could be used in industrial production.

pullulan;UItraviolet;low pigment;High yield

TQ920.1

A

2096-0387（2016）06-0027-03

張雪亮（1970-），男，浙江東陽(yáng)人，大專，工程師，研究方向：生物發(fā)酵。