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生淀粉結(jié)合域SBD及糖化酶基因在畢赤酵母中的融合表達(dá)*

0引言

【研究意義】淀粉能被多種淀粉酶水解，但這些酶中大約只有10%能結(jié)合并降解生淀粉[1]，其中生淀粉糖化酶(Raw starch-digesting glucoamylase，RSGA)是一種可以水解生淀粉的葡萄糖糖化生淀粉酶，可直接將未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉降解成為葡萄糖，并可將淀粉發(fā)酵酒精中的糊化、液化、糖化三步變?yōu)橐徊?，省去現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酒精過程中的淀粉前期處理工藝，節(jié)約能源消耗，降低發(fā)酵生產(chǎn)酒精的成本。RSGA通常具有一個明顯的序列結(jié)構(gòu)模塊，即淀粉結(jié)合域SBD(Starch-binding domains,SBD)[2]。真菌中的糖化酶所含有的SBD序列一般包括大約100個氨基酸殘基，是一個由7個β鏈組成扭曲而且開放的β桶形結(jié)構(gòu)[3-4]。文獻(xiàn)[2,5]證明，SBD可以在整個蛋白結(jié)構(gòu)中保持獨立的功能，與糖化酶或淀粉酶融合后可顯著增加不溶性淀粉在酶分子活性中心的濃度，賦予普通糖化酶或淀粉酶降解生淀粉的能力?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌、真菌的α-淀粉酶、β-淀粉酶、細(xì)菌的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶以及真菌的糖化酶中都存在淀粉結(jié)合域[6]。本實驗室楊鍵等[7]將SBD插入α-淀粉酶(CN7A)基因的5′端融合表達(dá)，淀粉酶酶活提高8.7倍，另有研究證明來源米根霉的糖化酶生淀粉酶活力顯著，生淀粉利用率為65%～70%，可以通過基因克隆和融合表達(dá)的方式，進(jìn)一步提高生淀粉酶的活力?！颈狙芯壳腥朦c】目前對該結(jié)合域融合表達(dá)的研究較少，而將淀粉結(jié)合域連接到糖化酶實現(xiàn)融合表達(dá)的研究國內(nèi)并未有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】筆者在前期的工作中篩選得到一株產(chǎn)酸性糖化酶的黑曲霉ASP-S21，該酶在酸性條件下穩(wěn)定性好且酶活力高，但降解生淀粉的酶活較低。經(jīng)基因測序發(fā)現(xiàn)該基因未含有生淀粉結(jié)合域，因此將實驗室原保藏的米曲霉生淀粉結(jié)合域SBD片段與糖化酶基因在畢赤酵母中融合表達(dá)，提高其水解生淀粉能力和表達(dá)量，以期得到能在酸性環(huán)境下降解生淀粉的糖化酶。

1材料和方法

1.1材料

黑曲霉ASP-S21由本實驗室篩選，pPIC9K載體及畢赤酵母GS115 來自Invitrogen 公司?；虿僮飨嚓P(guān)酶購自大連TaKaRa生物工程公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas，酵母基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、小型質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自上海華舜生物工程有限公司，其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口的分析純和生化試劑，實驗所用到的YPD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基均按Invitrogen公司酵母操作手冊方法配制。

1.2引物的設(shè)計及合成

根據(jù)已報道的黑曲霉糖化酶基因序列及淀粉結(jié)合域SBD基因序列，參照In-fusion TM PCR Cloning Kit 的使用說明，將SBD片段及糖化酶基因片段通過引物的退火互補(bǔ)串聯(lián)連接，再將串聯(lián)片段連接入載體pPIC9K，為此，設(shè)計以下引物，下劃線分別為引入的酶切位點EcoRⅠ和NotⅠ：

psg1-1：5′ -AGCTTACGTAGAATTCGCAA-

GTATTCCTAGCAGTGCTT-3′,

psg1-2：5′-GCGCTTGGAAATCACTGTAGA-

TACTTGGTAATTGGCA-3′;

psg2-1：5′-TACCAAGTATCTACAGTGATT-

TCCAAGCGCGCGACCTTG-3′,

psg2-2：5′-AATTAATTCGCGGCCGCCTAG-

AGATTCCGCCAGGTGT-3′;

pg-1：5′-ATAGAATTCGTGATTTCCAAGC-

GCGCGACCTTG-3′,

pg-2：5′-TAAGCGGCCGCCTAGAGATTCC-

GCCAGGTGT-3′。

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3重組畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-pg及pPIC9K-psg的構(gòu)建

利用液體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)黑曲霉，收集菌體，菌體用液氮研磨后，用mRNA 抽提純化試劑盒提取mRNA。以黑曲霉mRNA 做模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)的使用指南合成黑曲霉的雙鏈cDNA。以pg-1/pg-2為引物，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增得到的glu片段經(jīng)純化后，用EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切后，與同樣雙酶切的載體pPIC9K用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至E.coli JM109，涂布在氨芐抗性的LB平板，抽提陽性轉(zhuǎn)化子，用EcoRⅠ、NotⅠ酶切驗證與測序，得到正確的表達(dá)載體命名為pPIC9K-pg。

利用In-Fusion克隆技術(shù)得到的SBD-glu串聯(lián)片段與載體pPIC9K按照上述方法構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-psg。

1.4酵母轉(zhuǎn)化與高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選

利用XbaⅠ酶切位點對重組質(zhì)粒pPIC9K-pg與pPIC9K-psg進(jìn)行線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，電轉(zhuǎn)化方法參見Invitrogen公司操作手冊。利用MD和MM平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選，在不同G418濃度(0.25 mg/mL、0.50 mg/mL、0.75 mg/mL、1.00 mg/mL、1.50 mg/mL、2.00 mg/mL)的YPD培養(yǎng)基平板進(jìn)行高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選。

1.5轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測

挑取有高拷貝數(shù)的重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-psg、GS115/pPIC9K-pg轉(zhuǎn)化子，接種至5 mL BMMY液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)至OD600達(dá)到2.0～4.0，5 000 r/min離心5～10 min收集菌體，再用BMGY液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至OD600為1.0，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h補(bǔ)加甲醇以繼續(xù)誘導(dǎo)，72 h后收集酶液，測定酶活，同時8 000 r/min離心10 min取上清液，利用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物[8]。

1.6酶活力測定

將0.4 mL的1%(W/V)可溶性淀粉與0.3 mL pH值為4.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L)混合后置于65℃保溫10 min，再加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，反應(yīng)10 min后，立即加入0.8 mL的3，5-二硝基水楊酸(DNS)終止反應(yīng)并測定還原糖。以在上述條件下反應(yīng)后，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖(葡萄糖當(dāng)量)所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

1.7酶的生淀粉降解性質(zhì)分析

用pH值為4.4檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L)配制成1%(W/V) 的木薯生淀粉懸液作為底物。首先在50 mL的錐形瓶中加入4 mL底物，50℃ 預(yù)熱10 min，再加入經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液1 mL，50℃恒溫振蕩(180 r/min)反應(yīng)1 h后，加入0.5 mL、4% (W/V)NaOH終止反應(yīng)，最后取適當(dāng)體積的反應(yīng)液于5 000 r/min離心5 min，取上清液用DNS法測定還原糖量[9]。

1.8生淀粉降解能力(RDA)計算

根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法，RDA=B/A×100% ，其中B為降解生淀粉酶活，A為降解糊化淀粉酶活。

1.9PSG和PG最適條件及熱穩(wěn)定性分析

PSG及PG酶液在65℃下分別保溫1 min、3 min、5 min、10 min和15 min取出后測定其殘余酶活，繪制融合酶與原始酶的時間與殘余酶活之間的關(guān)系曲線。在不同溫度(40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、90℃)下測定pH值為4.4條件下的酶活力，繪制溫度與相對酶活之間的關(guān)系曲線。以不同pH值(2.2，3.0，4.0，4.4，5.0，5.4，6.0，6.4，7.0，8.0，9.0)緩沖液配制的可溶性淀粉溶液為底物，在65℃分別測定融合酶與原始酶的酶活，得到pH值與相對酶活的關(guān)系曲線。

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pPIC9K-pg與pPIC9K-psg的構(gòu)建

利用所設(shè)計的3對引物PCR擴(kuò)增得到黑曲霉糖化酶基因glu及淀粉結(jié)合域SBD基因片段(圖1)，將圖1中2號位的片段連接上T載體后測序，在NCBI上進(jìn)行比對確定該片段為不含生淀粉結(jié)合域的黑曲霉糖化酶基因glu。

1:DL2000 DNA Marker;2:PCR product of glu;3:PCR product of SBD

圖1glu和SBD PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

Fig.1Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product of glu and SBD

由圖2顯示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPIC9K-pg及pPIC9K-psg進(jìn)行酶切鑒定、測序，確定糖化酶基因glu與淀粉結(jié)合域SBD均與表達(dá)載體pPIC9K的α因子信號肽3′端融合，并且閱讀框架正確無誤。

1:λDNA/HindⅢ;2:pPIC9K-psg/EcoRⅠ,NotⅠ;3:pPIC9K-pg/EcoRⅠ,NotⅠ

圖2重組質(zhì)粒pPIC9K-pg及pPIC9K-psg的酶切驗證

Fig.2Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant plasmid pPIC9K-pg and pPIC9K-psg

2.2重組質(zhì)粒pPIC9K-psg與pPIC9K-pg的誘導(dǎo)表達(dá)

由圖3可知，含pPIC9K-psg與pPIC9K-pg轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液與不含質(zhì)粒的原始菌比較均多出一條約為101 kDa大小的蛋白條帶，表明目的蛋白得到了分泌表達(dá)。但PG及PSG表達(dá)蛋白所表現(xiàn)出的實際分子質(zhì)量均大于理論值，因此推測這是畢赤酵母對目的蛋白進(jìn)行糖基化修飾的結(jié)果。

Mark：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組酵母GS115/pPIC9K;2：重組酵母GS115/pPIC9K-pg;3：重組酵母GS115/pPIC9K-psg

Mark:molecular mass markers;1:Recombinant yeast GS115/pPIC9K;2:Recombinant yeast GS115/pPIC9K-pg;3:Recombinant yeast GS115/pPIC9K-psg

圖3PSG及PG在畢赤酵母中表達(dá)的SDS-PAGE

Fig.3SDS-PAGE analysis of PSG and PG expression in P.pastoris

2.3融合酶PSG及原始酶PG的酶學(xué)性質(zhì)比較

2.3.1糖化酶活力以及水解生淀粉能力

由表1可知，PG測得糖化酶活力為7.72 U/mL，生淀粉酶活力為1.84 U/mL，RDA值為23.8%。轉(zhuǎn)化子PSG糖化酶活力為7.81 U/mL，生淀粉酶活力為2.64 U/mL，RDA值為33.8%。降解生淀粉的能力較未加SBD結(jié)合域的菌株提高29.6%，比原始菌株提高86.5%。

2.3.2最適作用條件及熱穩(wěn)定性分析

由圖4～6可知，融合酶的熱穩(wěn)定性并沒有顯著變化。最適作用溫度，最適作用pH值也與原始酶相同，分別為65℃和4.8，但在高溫條件(70～85℃)及偏酸性、堿性條件(pH值為4.0,6.4～8.0)下融合酶的相對酶活均有所提高。

表1PSG與PG的糖化酶活力以及水解生淀粉能力比較

Table 1Comparision of glucoamylase activity and raw cassava starch hydrolyzing activity between the fusion enzyme and the wildtype

菌株編號Strainnumber糖化酶活力Glucoamylaseactivity(U/mL)生木薯粉酶活Rawcassavastarchhydroly-sisactivity(U/mL)生淀粉降解能力RDA(%)ASPS21136.34±0.240.39±0.084.57±0.25PG37.72±0.351.84±0.0523.80±0.80PSG27.81±0.212.64±0.1433.80±1.43

圖4　PG及PSG在65℃下的熱穩(wěn)定性

圖5　溫度對PG及PSG酶活力的影響

圖6pH值對PG及PSG酶活力的影響

Fig.6pH value effects on PG and PSG activity

3結(jié)論

本研究將篩選得到的黑曲霉ASP-S21糖化酶基因與實驗室原有的米曲霉SBD生淀粉結(jié)合域基因在畢赤酵母中融合表達(dá)，對融合酶與原始酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，可知：(1)測得原始酶轉(zhuǎn)化子的PG糖化酶酶活力為7.72 U/mL，生淀粉酶活力為1.84 U/mL，RDA值為23.8%；融合轉(zhuǎn)化子的PSG糖化酶活力為7.81 U/mL，生淀粉酶活力為2.64 U/mL，RDA值為33.8%。(2)PSG降解生淀粉的能力比PG提高29.6%，比原始菌株提高86.5%，即融合酶較原始酶具有降解生淀粉的能力。(3)融合酶的最適反應(yīng)溫度、pH值及熱穩(wěn)定性均與原始酶基本相同，但反應(yīng)溫度及pH值的范圍均變得更為寬泛，融合酶在反應(yīng)溫度60～70℃，pH值為4.0～7.0時較為穩(wěn)定。該融合酶對用生淀粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精具有重要的推動作用。

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(責(zé)任編輯：竺利波)

Fusion Expression of Raw Starch Binding Domain with Glucoamylase in Pichia pastoris

朱婧，劉海余，王青艷，米慧芝，朱綺霞，廖思明，秦艷，申乃坤，黃日波**

ZHU Jing,LIU Haiyu，WANG Qingyan,MI Huizhi,Zhu Qixia,LIAO Siming,QIN Yan,SHEN Naikun,HUANG Ribo

(廣西科學(xué)院 國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530007)

(National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery，Guangxi Academy of Sciences，Nanning，Guangxi，530007，China)

摘要：【目的】研究生淀粉結(jié)合域SBD及糖化酶基因在畢赤酵母中的融合表達(dá)，提高酶的表達(dá)量和水解生淀粉的能力?！痉椒ā坷肐n-fusionTM PCR克隆技術(shù)將淀粉結(jié)合域SBD無縫隙插入到黑曲霉糖化酶基因glu的5′端構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-psg，實現(xiàn)融合酶基因psg在畢赤酵母GS115中的高效表達(dá)，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。【結(jié)果】融合酶的最適作用條件及熱穩(wěn)定性均與原始酶無明顯差別，但反應(yīng)溫度及pH值的范圍更為寬泛，在反應(yīng)溫度60～70℃，pH值為4.0～7.0時均較穩(wěn)定；融合酶PSG降解生淀粉的能力較原始酶PG提高29.6%，比原始菌株提高86.5%?！窘Y(jié)論】淀粉結(jié)合域SBD的融合提高了糖化酶水解生淀粉的能力。

關(guān)鍵詞：黑曲霉ASP-S21生淀粉糖化酶淀粉結(jié)合域In-fusion TM PCR Cloning融合表達(dá)畢赤酵母GS115

Abstract:【Objective】In order to improve the expression of glucoamylase from Aspergillus niger ASP-S21 and the hydrolysis ability of raw starch,the fusion expression of starch binding domain(SBD) with glu was conducted in Pichia pastoris GS115.【Methods】The fusion expression plasmid was constructed by inserting the SBD fragment to 5′-end of glucoamylase gene glu with In-fusionTM PCR Cloning technology.The recombinant enzyme(PSG)was over expressed in Pichia pastoris GS115 and its enzymatic properties were characterized.【Results】The PSG showed strong raw cassava starch hydrolyzing activity，which was 29.6% higher than the wildtype PG,and 86.5% higher than parental strain.The reaction temperature and pH of the acfusion enzyme were more broad than that of the wildtype.It was stable in temperature range of 60～70℃ and pH range from 4.0 to 7.0.【Conclusion】The fusion of SBD with glucoamylase enables the fusion enzymes to hydrolyze raw starch more effectively.

Key words:Aspergillus niger ASP-S21,raw starch-digesting glucoamylase,starch-binding domain(SBD),In-fusionTM PCR Cloning,fusion expression,Pichia pastoris GS115

中圖分類號：TS231，Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)01-0007-05

作者簡介：朱婧(1983-)，女，助理研究員，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。

收稿日期：2015-01-27

修回日期：2015-03-12

*國家自然科學(xué)基金項目(No.31160023)，廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(桂科合14123001-19)，廣西自然科學(xué)基金項目(No.2013GXNSFBA019102)，八桂學(xué)者建設(shè)工程專項經(jīng)費和2014年留學(xué)人員科技活動項目資助。

**通訊作者：黃日波(1958-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物生物技術(shù)以及酶工程研究，E-mail:rbhuang@163.com。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(1):7～11

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-15

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1516.036.html