王玉路，王宗義，賈昌喜，姜懷璽，李德美，楊曼

(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京北農(nóng)葡萄酒工程技術(shù)中心，北京，102206)

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葡萄酒釀造過(guò)程中12種殘留殺菌劑的歸趨追蹤

王玉路，王宗義*，賈昌喜，姜懷璽，李德美，楊曼

(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京北農(nóng)葡萄酒工程技術(shù)中心，北京，102206)

摘要追蹤了葡萄酒釀造過(guò)程中12種殘留殺菌劑的歸趨，為葡萄酒殘留控制提供了有實(shí)用價(jià)值的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，各殺菌劑的酒渣殘留分量為41.63%～95.91%，平均為66.08%； 酒泥殘留分量為1.25%～21.40%，平均9.54%； 降解分量為2.43%～40.45%，平均為17.24%，其中酒精發(fā)酵期無(wú)降解，二次發(fā)酵期降解分量為2.09%～17.62%，平均為10.82%，陳釀期(陳釀3個(gè)月時(shí))降解分量為0.84%～23.46%，平均為6.42%；酒汁中各殺菌劑的平均殘留分量最低，為7.14%，各殘留分量分別為多菌靈20.56%、甲霜靈14.32%、精甲霜靈9.34%、嘧霉胺7.15%、烯酰嗎啉6.49%、氟環(huán)唑2.66%、戊唑醇2.33%、氟硅唑1.71%、咪鮮胺0.40%、吡唑醚菌酯1.00%和腐霉利12.55 %，且與其logP值顯著負(fù)相關(guān)，脂溶性越強(qiáng)，葡萄酒中的殘留分量越小。

關(guān)鍵詞殺菌劑殘留;葡萄酒;釀造;歸趨追蹤

伴隨我國(guó)葡萄酒消費(fèi)量的不斷提升[1]和葡萄酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[2-3]，葡萄酒的質(zhì)量安全和品質(zhì)也越來(lái)越受到人們的重視。農(nóng)藥殘留就是被關(guān)注的問(wèn)題之一，它不僅影響影響葡萄酒的質(zhì)量安全，還會(huì)對(duì)感官質(zhì)量帶來(lái)不良影響[4]。目前，我國(guó)無(wú)論是葡萄，還是葡萄酒，在農(nóng)藥殘留的控制方面，同國(guó)際葡萄酒主產(chǎn)國(guó)相比，都相對(duì)滯后[5-6]。

關(guān)于葡萄酒釀造過(guò)程中農(nóng)藥歸趨行為的研究，是指導(dǎo)葡萄園合理使用農(nóng)藥，改進(jìn)釀造工藝，從而最大限度減少酒體中的農(nóng)藥殘留，獲得高品質(zhì)葡萄酒的重要依據(jù)。研究表明，釀造過(guò)程中，葡萄中的殘留農(nóng)藥在液固兩相進(jìn)行重新分配，更傾向吸附于酒渣和酒泥[7-9]，再加之釀造過(guò)程中的降解[10]，使得殘留于酒汁中農(nóng)藥較葡萄原樣顯著減少。盡管這些歸趨行為已基本清楚，但不同性質(zhì)的農(nóng)藥，其殘留轉(zhuǎn)移到酒汁的分量并不相同[11]；又因受用藥品種、用藥歷史和環(huán)境特點(diǎn)的影響，不同國(guó)家、不同地域葡萄的農(nóng)藥殘留情況也不相同。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)葡萄樣品的農(nóng)藥篩查分析結(jié)果，選擇12種經(jīng)常檢出的殺菌劑，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)其實(shí)際殘留進(jìn)行了釀造追蹤分析，以期為葡萄酒的農(nóng)藥殘留控制提供具有實(shí)用價(jià)值的數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

玫瑰香葡萄，購(gòu)自北京昌平區(qū)回龍觀城北市場(chǎng)； Zymaflore F15酵母菌、果膠酶和酵母營(yíng)養(yǎng)劑，法國(guó)Laffort公司。

固相萃取小柱，Cleanert NH2，500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司；50 mL塑料離心管，BD Bioscience公司。

各種殺菌劑(見(jiàn)表1)定值標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量濃度為100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；色譜乙腈、甲醇和甲苯，Burdick & Jackson, Honeywell公司；色譜級(jí)甲酸、乙酸，分析純無(wú)水硫酸鈉、6%亞硫酸、無(wú)水硫酸鎂和無(wú)水乙酸鈉，北京化學(xué)試劑公司。

1.2儀器設(shè)備

Agilent 6410 Triple Quad LC/MS系統(tǒng)，Zorbax SB-C18色譜柱(3.5 μm，150 mm×2.1 mm)，美國(guó)安捷倫科技有限公司；AWL-1002-U艾科浦超純水系統(tǒng)，重慶順洋企業(yè)發(fā)展有限公司；BT125D電子天平(0.1 mg)，賽多利斯公司；FSH-2可調(diào)高速勻漿機(jī)，常州國(guó)華電器有限公司；IKA-MS3渦旋混合器，德國(guó)伊卡公司；BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x，北京八方科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；H1850R離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3葡萄酒釀造與取樣

取9 kg經(jīng)去梗、挑去腐爛和破損籽粒的葡萄，于20 L不銹鋼發(fā)酵桶中，用不銹鋼攪拌棒搗碎。加入9 mL 6 %的亞硫酸溶液混勻，再分別加入0.27 g果膠酶和4.5 g酵母(酵母需提前經(jīng)37 ℃活化，加葡萄汁培養(yǎng)15 min)攪拌均勻，進(jìn)行酒精發(fā)酵(約7 d)。每天攪拌1次，并測(cè)定發(fā)酵液的密度，待葡萄汁密度下降到0.995 g/cm3時(shí)，發(fā)酵完成。將發(fā)酵液通過(guò)紗布過(guò)濾到20 L廣口瓶中，蓋好蓋子，自然啟動(dòng)二次發(fā)酵(蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵)，約10 d左右發(fā)酵完成。分離酒泥后，酒液裝瓶，加入2滴亞硫酸溶液后，打塞，置于酒窖陳釀。釀造實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)重復(fù)。

分別于發(fā)酵前采集葡萄樣本，于酒精發(fā)酵開(kāi)始、中間、結(jié)束時(shí)，以及二次發(fā)酵結(jié)束時(shí)，采集漿液和酒汁樣本；于酒精發(fā)酵和乳酸蘋(píng)果酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)采集酒渣和酒泥樣本。葡萄和酒渣樣本裝于塑料樣品袋中，發(fā)酵液和酒泥樣本分裝于50 mL離心管中，所有樣本冷凍保存(-18 ℃)。

1.4分析方法

參照GB/T 23206—2008[12]進(jìn)行。樣品經(jīng)室溫解凍后，稱(chēng)取10 g(精確到0.000 1 g)樣品于50 mL螺口塑料離心管中(其中葡萄和酒渣需打漿破碎均勻后取樣)，準(zhǔn)確加入10 mL含體積分?jǐn)?shù)為1%乙酸的乙腈溶液，旋緊蓋子，渦旋混合2 min；再加1 g無(wú)水乙酸鈉，振蕩1 min，加4 g無(wú)水硫酸鎂，振蕩2 min，4 200 r/min離心5 min。

將氨基固相萃取柱中裝入高約為2 cm經(jīng)650 ℃脫水4 h的無(wú)水硫酸鈉，用5 mL乙腈甲苯溶液(3+1，v/v)活化后，移取上述離心清液5.00 mL于小柱上，用25 mL乙腈甲苯溶液(3+1, v/v)洗脫，洗脫液于40 ℃減壓濃縮至約0.5～1 mL，再于35 ℃下氮?dú)獯蹈?，? mL乙腈水溶液(3+2，v/v)復(fù)溶，再經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾于進(jìn)樣瓶中，于國(guó)標(biāo)法給定的分析條件下進(jìn)行色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)。

2結(jié)果與討論

2.1葡萄樣本中12種殺菌劑的定量結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)葡萄樣品的農(nóng)藥篩查結(jié)果，選擇12種常被檢出的殺菌劑，對(duì)本次實(shí)驗(yàn)用的葡萄樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1，該12種殺菌劑均被檢出，但含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家食品安全限量，這一定程度上也說(shuō)明市場(chǎng)上的葡萄農(nóng)藥殘留水平是安全的。該12種殺菌劑均為登記可用于葡萄的常用農(nóng)藥品種，其中多菌靈、嘧霉胺、烯酰嗎啉、吡唑醚菌酯和腐霉利，有相對(duì)較高的殘留量。

表1　葡萄中12種殺菌劑的測(cè)定結(jié)果

2.2葡萄酒釀造過(guò)程中各殺菌劑的追蹤

不同釀造階段，12種殺菌劑殘留量的定量追蹤結(jié)果見(jiàn)表2，其中甲基硫菌靈在釀造各階段的樣品中均未檢出(以下不再做討論)。酒精發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，發(fā)酵液中目標(biāo)殺菌劑的含量明顯低于其在葡萄原樣中的含量，這是因?yàn)榘l(fā)酵液中不包含葡萄表皮和籽的緣故；在酒精發(fā)酵階段各農(nóng)藥沒(méi)有觀察到明顯的下降趨勢(shì)，其中嘧霉胺、吡唑醚菌酯等的濃度還有上升的趨勢(shì)，這可能是表皮和籽中這2種殺菌劑隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸釋放到發(fā)酵液中造成；酒精發(fā)酵結(jié)束后的酒渣和二次發(fā)酵發(fā)結(jié)束后的酒泥中目標(biāo)農(nóng)藥都極顯著高于相應(yīng)發(fā)酵液和酒汁；陳釀3個(gè)月的酒汁中目標(biāo)農(nóng)藥與二次發(fā)酵結(jié)束時(shí)相比，目標(biāo)農(nóng)藥也有顯著下降趨勢(shì)。

2.3葡萄酒釀造過(guò)程中各殺菌劑的殘留歸趨分析

由于不同葡萄品種和不同成熟度，酒汁、酒渣和酒泥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)各不相同，本實(shí)驗(yàn)使用的發(fā)酵過(guò)程中酒汁、酒渣和酒泥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.8,0.1和0.1。由表2可知，酒精發(fā)酵階段發(fā)酵液中的目標(biāo)殺菌劑沒(méi)有明顯的降解趨勢(shì)；酒精發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)酒渣和發(fā)酵液(酒漿)中目標(biāo)殺菌劑的含量計(jì)算得到的殺菌劑總量與葡萄原樣中的殺菌劑總量相當(dāng)，說(shuō)明酒精發(fā)酵期殺菌劑降解不明顯，與CABONI等[9]的報(bào)道相一致；同樣根據(jù)蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒泥和酒汁中目標(biāo)殺菌劑含量計(jì)算獲得的總量，明顯低于與發(fā)酵開(kāi)始時(shí)酒漿中殺菌劑總量，說(shuō)明蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵期目標(biāo)殺菌劑存在明顯的降解；陳釀期(3個(gè)月)也觀察到目標(biāo)殺菌劑有明顯的降解。

表2　不同發(fā)酵階段發(fā)酵液中12種殺菌劑殘留的監(jiān)測(cè)結(jié)果

注：1)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的偏差小于15%，不再一一列出；2.ND 未檢出。

因此，為消除測(cè)定誤差的影響，可近似用酒精發(fā)酵期發(fā)酵罐中(酒渣和發(fā)酵液)各殺菌劑的總量為基礎(chǔ)，對(duì)整個(gè)釀造過(guò)程農(nóng)藥歸趨進(jìn)行分析，見(jiàn)表3。

表3　釀造過(guò)程中各殺菌劑的歸趨

注：目標(biāo)農(nóng)藥總濃度 (μg/kg) = 發(fā)酵液中目標(biāo)農(nóng)藥濃度(酒精發(fā)酵期)× 0.90 + 酒渣中目標(biāo)農(nóng)藥濃度× 0.10；

酒渣中的殘留分量(%) = 酒渣中目標(biāo)農(nóng)藥濃度×0.10 / 目標(biāo)農(nóng)藥總濃度×100；

酒泥中的殘留分量(%) = 酒泥中目標(biāo)農(nóng)藥的濃度×0.10/目標(biāo)農(nóng)藥總濃度×100；

酒汁中的殘留分量 (%) = 酒汁中目標(biāo)農(nóng)藥的濃度(陳釀結(jié)束時(shí)) × 0.80/目標(biāo)農(nóng)藥總濃度×100；

農(nóng)藥總降解分量(%) = 100-酒渣中目標(biāo)農(nóng)藥的殘留分量(%)-酒泥中目標(biāo)農(nóng)藥的殘留分量(%)-葡萄酒中目標(biāo)農(nóng)藥的殘留分量(%)；

二次發(fā)酵期降解分量(%) ={發(fā)酵液中目標(biāo)農(nóng)藥濃度(酒精發(fā)酵期) × 0.90-酒汁中目標(biāo)農(nóng)藥的濃度(二次發(fā)酵結(jié)束)× 0.80-酒泥中目標(biāo)農(nóng)藥的濃度 × 0.10}/目標(biāo)農(nóng)藥總濃度× 100;

陳釀期降解分量(%) = 農(nóng)藥總降解(%)-二次發(fā)酵期降解分量(%)。

結(jié)果表明，酒汁中殺菌劑的殘留分量為0.40%～20.56%，平均為7.14%，其中多菌靈、精甲霜靈、甲霜靈、嘧霉胺、烯酰嗎啉和腐霉利有相對(duì)較高的殘留分量，這解釋了多菌靈等殺菌劑易于葡萄酒中檢出的原因；雖然酒泥中目標(biāo)殺菌劑的濃度較高，但由于酒泥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小，其中的殺菌劑殘留分量只占1.25%～21.40%，平均為9.54%；殺菌劑的降解主要發(fā)生在二次發(fā)酵期和陳釀期，到陳釀3個(gè)月時(shí)殺菌劑降解總分量為2.43%～40.45%，平均為17.24%，其中二次發(fā)酵期殺菌劑殘留降解2.09%～18.17%，平均為10.82%。酒渣是殘留殺菌劑的最主要去向，為41.63%～95.91%，平均為66.08%。

雖然殺菌劑降解分量和酒泥中殺菌劑殘留分量都相對(duì)較小，但在去除酒渣后，通過(guò)酒泥沉淀可去除剩余殺菌劑(發(fā)酵液中)平均超過(guò)30%(依表3計(jì)算)，再通過(guò)陳釀期的進(jìn)一步降解，陳釀3個(gè)月時(shí)可再去除剩余殺菌劑平均超過(guò)50%(依表3計(jì)算)，因此，通過(guò)酒泥沉淀和適當(dāng)?shù)年愥効山徊接行コ咸丫浦械霓r(nóng)藥殘留。工業(yè)釀酒，通常還會(huì)加入澄清劑，其中用木炭和做澄清劑時(shí)，還會(huì)有效吸附部分農(nóng)藥[7],關(guān)于使用澄清劑本文不作討論。

酒汁中殺菌劑的殘留水平，除決定于其葡萄的殘留水平外，還主要取決于其酒汁的殘留分量。將表3中的lgP值與酒汁中相應(yīng)殺菌劑的殘留分量進(jìn)行回歸，還可觀察到兩者之間呈顯著的負(fù)相關(guān)(R2=0.667)，見(jiàn)圖1，lgP值越大，即脂溶性越大，酒汁中對(duì)應(yīng)殺菌劑的殘留分量越小，因此可通過(guò)殺菌劑lgP值的大小，對(duì)其酒汁的殘留分量進(jìn)行判斷，這也為指導(dǎo)葡萄園合理用藥提供了直觀的依據(jù)。

3結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)葡萄樣品進(jìn)行殺菌劑的測(cè)定和釀造實(shí)驗(yàn)，對(duì)檢出的12種常用殺菌劑進(jìn)行追蹤分析，為葡萄酒中的農(nóng)藥殘留控制提供了具有實(shí)用價(jià)值的數(shù)據(jù)。研究表明， 葡萄中檢出的12種殺菌劑， 除含量較低的甲基硫菌靈之外，其他在釀造的各個(gè)階段均有檢出；各殺菌劑酒渣殘留為41.63%～95.91%，平均為66.08%，是主要去向；其次是釀造過(guò)程的降解，為2.43%～40.45%，平均為17.24%，其中在酒精發(fā)酵期沒(méi)有觀測(cè)到明顯降解，降解主要發(fā)生在二次發(fā)酵期和陳釀期；再次是酒泥中的殘留，為1.25%～21.40%，平均9.54%；酒泥的沉淀，二次發(fā)酵和陳釀期降解，在酒渣分離后進(jìn)一步去除發(fā)酵液中的殺菌劑殘留發(fā)揮重要作用；酒汁中殺菌劑的平均殘留最低，僅為7.14%，酒汁中各殺菌劑的殘留分量分別為，多菌靈20.56%、甲霜靈14.32%、精甲霜靈9.34%、嘧霉胺7.15%、烯酰嗎啉6.49%，氟環(huán)唑2.66%，戊唑醇2.33%，氟硅唑1.71%，咪鮮胺0.40%，吡唑醚菌酯1.00%和腐霉利12.55；酒汁中殺菌劑的殘留分量與其logP值顯著負(fù)相關(guān)，脂溶性越強(qiáng)，葡萄酒中的殘留分量越小。

圖1　殺菌劑lgP值與其酒汁中殘留分量的關(guān)系Fig.1　The correlation between of the residues fraction of fungicides and their lgP values

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Fate tracing for 12 residual fungicides in grapes during vinification process

WANG Yu-lu, WANG Zong-yi*, JIA Chang-xi，JIANG Huai-xi,LI De-mei, YANG Man

(Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control for Spoilage Organisms and Pesticides, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing Capital Wine Technology & Engineering Center, College of Food Sciences and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

ABSTRACTThe fate of 12 residual fungicides detected in grapes was traced during vinification process and useful data were provided for the control of fungicides residues in wines. Results showed that fractions of residues in cakes and lees for all fungicides were from 41.63% to 95.91% with an average of 66.08% and from 1.25% to 21.40% with an average of 9.45%, respectively. Fractions of degradation were from 2.43% to 40.45% with an average of 17.24%. Degradation was not observed for all fungicides during alcoholic fermentation, while it occurred mainly during the malolactic fermentation about 2.09%-17.62% with an average of 10.82% and during the storage about 0.84% to 23.46% with an average of 6.42%. The contents of residual fungicides in wine were 20.56% for carbendazim, 14.32% for mefenoxam, 9.34% for metalaxyl, 7.15% for pyrimethanil, 6.49% for dimethomorph, 2.66% for epoxiconazole, 2.33% for tebuconazole, 1.71% for flusilazole, 0.40% for prochloraz, 1.00% for pyraclostrobin, and 12.55 % for procymidone, The lowest average value was 7.14%. Significant negative correlation was observed between the fractions of residual fungicides in wine for and their logP values, which meant that the higher logP value the lower content of residual fungicides in wine.

Key wordsfungicides residues; wine; vinification; fate tracing

收稿日期：2015-02-14，改回日期：2015-04-14

基金項(xiàng)目：北京市教委項(xiàng)目(KM201310020009；PXM2014-014207-000001)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603020

第一作者：碩士研究生(王宗義副教授為通訊作者，E-mail：wangzongyi001@sina.com)。