包海洋 曹旭東 秦蓮花 楊華 吳長新 劉忠華 陳創(chuàng)夫

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·論著·

北疆地區(qū)結核分枝桿菌基因分型及耐藥性分析

包海洋 曹旭東 秦蓮花 楊華 吳長新 劉忠華 陳創(chuàng)夫

目的 對北疆地區(qū)結核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型和耐藥性檢測，研究不同基因型在該地區(qū)的流行及耐藥性。 方法 收集北疆地區(qū)114株結核分枝桿菌臨床分離株，采用間隔區(qū)寡核苷酸和多位點可變串聯(lián)重復序列(VNTR)技術進行基因分型，應用NTsys 2.10e軟件對結果進行聚類分析，比例法檢測臨床分離株的耐藥性。 結果 114株臨床分離株，間隔區(qū)寡核苷酸分型結果和RD105缺失檢測法結果共同顯示北京基因型占62.28%(71/114)、非北京基因型占37.72%(43/114)。分2大簇(A和B)：A簇有34株，北京基因型占11.77%(4/34)，非北京基因型占88.23%(30/34)；B簇有80株，北京基因型占83.75%(67/80)，非北京基因型占16.25%(13/80)。耐藥顯示：總耐藥率為40.35%(46/114)，耐多藥(MDR)率為19.30%(22/114)；北京基因型耐藥率為42.25%(30/71)，非北京基因型的耐藥率為37.21%(16/43)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.28，P=0.60)。其中，北京基因型MDR耐藥菌株占22.54%(16/71)結論 北疆地區(qū)北京基因型和非北京基因型的耐藥率沒有差異，但MDR菌株流行主要是由北京基因型引起的。

分枝桿菌，結核； 基因型； 抗藥性，細菌

結核病作為一種古老的疾病仍在危害著人類的健康，結核分枝桿菌耐藥株的出現(xiàn)及廣泛流行給結核病的防控帶來了極大困難。隨著分子生物學的發(fā)展，可變串聯(lián)重復序列(variable number tandem repeat, VNTR)和間隔區(qū)寡核苷酸分型技術因其操作簡單、快速，以及數(shù)據(jù)易于統(tǒng)計和重復性高等特點，使其在結核分枝桿菌分型中被廣泛應用，也使人們能更好地了解結核分枝桿菌的流行情況[1-4]。2010年第五次結核病流行病學抽樣調(diào)查表明，活動性、痰涂片陽性結核病患病率全國分別是459/10萬、66/10萬；新疆則分別是1526/10萬、196/10萬。新疆地區(qū)總耐藥率為36.00%，總耐多藥率(MDR)為1.20%；以鏈霉素(Sm)和異煙肼(INH)耐藥最為常見[5-6]。本研究利用VNTR和間隔區(qū)寡核苷酸分型技術對北疆地區(qū)結核分枝桿菌菌株進行分型，研究北京基因型和非北京基因型在北疆地區(qū)的流行情況，并且研究各基因型的耐藥性，尤其是耐多藥結核病在北疆地區(qū)耐藥結核病中所占比例，為北疆地區(qū)結核病的防控提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、菌株來源

H37Rv標準株由新疆人畜共患病實驗室提供。2013年2月至2014年6月，從新疆胸科醫(yī)院和石河子市第二人民醫(yī)院收治的結核病患者的痰、支氣管灌洗液、胸腔積液、感染部位膿液中分離了114株結核分枝桿菌臨床分離菌株，并經(jīng)對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基和噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定；其中男71例，女43例；≤20歲1例，20～歲41例，40～歲35例，≥60歲37例。

二、主要實驗試劑

2×Taq PCR Master Mix、核酸染料均購自天根生物科技有限公司；分型所用引物由華大基因合成。

三、 菌株DNA制備

采用常規(guī)7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，待菌株生長到對數(shù)期，從培養(yǎng)基中吸取1 ml菌液置于1.5 ml EP管(Eppendorf公司生產(chǎn))中，80 ℃滅活1 h，8000×g離心5 min,棄上清后再加入50 μl DNA裂解液,99 ℃水浴10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、PCR反應

參考國內(nèi)外相關文獻報道中多態(tài)性較高的VNTR分型位點，確定7個VNTR分型位點miru10、miru16、miru23、miru26、miru27、miru39、miru40，其標準株H37Rv的擴增片段大小和重復片段大小及引物序列見表1[1-4]。

PCR擴增反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，61 ℃復性30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。采用2×Taq PCR Master Mix便捷式PCR試劑盒，各個位點的上下游引物終濃度均為0.2 μmol/L。

五、VNTR位點組合對菌株分辨力評價和成簇率分析

采用Hunter-Gaston指數(shù)(Hunter-Gaston diversity index，HGDI)評價不同VNTR位點組合的辨別能力[4]，公式如下：

N:實驗菌株總數(shù)；S：分型中實驗菌株不同基因型的數(shù)目；nj：第j個基因型的菌株數(shù)。

采用成簇率計算公式來計算7位點組合的成簇情況，公式如下：

成簇率=(NC-C)/N

Nc為成簇的總分離菌株數(shù)，C為簇數(shù)，N為總分離菌株數(shù)。

表1 7個VNTR重復區(qū)重復片段大小及引物序列

圖1 北疆結核分枝桿菌臨床分離菌株部分間隔區(qū)寡核苷酸分型圖譜

六、北京基因型和非北京基因型的測定

間隔區(qū)寡核苷酸分型方法見參考文獻[7]。采用RD105 缺失基因檢測法鑒定北京基因型菌株, 引物設計和PCR反應體系見參考文獻[8]。

七、耐藥性試驗

采用比例法對菌株進行鏈霉素(Sm)、異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB) 4種抗結核藥物的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)。4種藥物在羅氏(L-J)培養(yǎng)基中的終濃度分別為4.0、 0.2、40.0、2.0 μg/ml。

耐藥標準：含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基菌落數(shù)≥1%為耐藥。

八、數(shù)據(jù)分析

基因分型的數(shù)據(jù)在Microsoft Excel電子表格中表述為二進制格式，用NTsys 2.10e軟件進行聚類分析。耐藥數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用卡方檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、北京基因型和非北京基因型測定結果

間隔區(qū)寡核苷酸分型檢測結果：114株菌株中北京基因型71株，占62.28%；非北京基因型43株，占37.32%；部分結果見圖1。

為了驗證間隔區(qū)寡核苷酸分型準確性，采用RD105缺失基因檢測法測定北京基因型(部分結果見圖2)。結果114株菌株中北京基因型71株，占62.28%；非北京基因型43株，占37.32%。兩種檢測方法結果完全一致。

菌株若為北京基因型則可以擴增出284 bp的目的片段，若為非北京基因型則該片段缺失圖2 RD105缺失基因檢測法測定北京基因型

二、VNTR分型結果

采用7個基因位點對所收集的114株臨床株進行VNTR分型，分析不同基因位點的基因多態(tài)性，7個位點總分辨率指數(shù)(HGDI)為0.95，其中miru26位點分辨率指數(shù)最高(為0.73)，miru23位點分辨率指數(shù)最低(為0.04)。并且根據(jù)每株菌所對應的分型位點拷貝數(shù)用NTsys 2.10e軟件進行分析，并建立進化樹(圖3)。VNTR結果分析得到66個基因型，無獨特型基因型，共有33個簇，成簇菌株有82株，成簇率為71.9% (82/114)。菌株被分成A、B兩大簇：A簇有34株，北京基因型占11.8%(4/34)，非北京基因型占88.2%(30/34)；B簇有80株，北京基因型占83.8%(67/80)，非北京基因型占16.3%(13/80)。

MLVA：多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析圖3 114株結核分枝桿菌臨床株VNTR分型進化樹

三、 耐藥性結果

114株臨床株總耐藥率為40.35%(46/114)，其中4種抗結核一線藥的耐藥率分別為：Sm 28.95% (33/114)，INH 29.82%(34/114)，RFP 25.44%(29/114)，EMB 9.65%(11/114)(圖4A)。結果顯示新疆北疆地區(qū)耐藥結核分枝桿菌流行菌株耐藥以耐多藥為主，但多耐藥率為19.30%(22/114)占有較高比例(圖4B)。

圖4 114株結核分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況

四、北疆結核分枝桿菌VNTR分型結果和耐藥性之間的關系

對流行菌群進行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)北京基因型耐藥率為42.25%(30/71)，非北京基因型耐藥率為37.21%(16/43)，兩者差異無統(tǒng)計學意義(表2)；北京基因型MDR率為22.54%(16/71)，非北京基因型MDR率為13.95%(6/43)，MDR菌株流行主要是北京基因型引起的(表3)。

討 論

本研究所收集的菌株為新疆自治區(qū)胸科醫(yī)院和石河子第二人民醫(yī)院不間斷連續(xù)收集?；颊邅碜员?/p>

疆地區(qū)的主要市、縣及農(nóng)村地區(qū)。有文獻報道新疆地區(qū)結核分枝桿菌以北京基因型為主，占菌株總數(shù)的68.72%，非北京基因型占菌株總數(shù)的31.28%[4]。本研究結果顯示，114株臨床分離菌株中北京基因型占62.28%，非北京基因型占37.72%。結合文獻報道和本研究結果，北疆地區(qū)流行的結核分枝桿菌以北京基因型為主。VNTR分型中miru26位點分辨率最高，為0.73；而miru39分辨率最低，為0.04。其中miru26位點分辨率與浙江、安徽等地區(qū)相近[9-10]，由于這個位點對北疆地區(qū)菌株具有較高分辨率，所以可以作為北疆地區(qū)結核分枝桿菌分型的主要位點。

近年來，由北京基因型耐藥引起的結核病暴發(fā)及流行使北京基因型與耐藥性成為人們的研究熱點。有文獻報道，新疆地區(qū)北京基因型結核分枝桿菌的耐藥率遠高于非北京型[11]。本研究顯示，北疆地區(qū)臨床分離株北京基因型結核分枝桿菌耐藥率為42.25%、非北京基因型結核分枝桿菌耐藥率為37.21%，仍然以北京基因型為主，但非北京基因型結核分枝桿菌耐藥率也較高，兩者差異無統(tǒng)計學意義。同時，對北京基因型結核分枝桿菌耐藥菌株分析發(fā)現(xiàn)，北京基因型結核分枝桿菌的MDR率為22.54%(16/71)，顯示北疆地區(qū)MDR菌株流行主要是北京基因型結核分枝桿菌。目前MDR患者的治療需要5～6種抗結核藥物配合使用，療程長，而且大多采用的是療效較差、副作用大的二線藥，部分MDR患者甚至沒有有效的治療方案，提示北疆地區(qū)對MDR防控的嚴峻性。

表2 北京基因型和非北京基因型的耐藥及MDR例數(shù)比較分析

表3 A、B簇菌株中北京基因型和非北京基因型耐藥及MDR分析

為了預防和控制MDR，必須從源頭清除結核分枝桿菌耐藥的產(chǎn)生，國內(nèi)外已經(jīng)證實DOTS策略是預防和控制MDR產(chǎn)生的最佳措施，美國、古巴等地區(qū)在推行DOTS措施后，對于預防和控制MDR的成效明顯。所以，北疆地區(qū)的結核病尤其是MDR結核病的防治工作還需進一步加強和完善。

由于本研究收集樣本的時間短，樣本量少，并且局限于北疆地區(qū)，因此有一定的局限性，并不能代表整個新疆地區(qū)的流行情況。南疆喀什地區(qū)的耐藥結核病研究表明，南疆地區(qū)結核分枝桿菌耐藥率略低于本研究的耐藥率[12]，由于僅限于喀什地區(qū)，所以后期研究主要是擴大南疆地區(qū)及全疆重點地區(qū)人群的結核病患者結核分枝桿菌臨床分離株的收集和分析，以期全面地研究新疆結核感染的流行情況。

新疆位于我國西北部，地域廣闊，經(jīng)濟發(fā)展與東部地區(qū)相比較緩慢，醫(yī)療水平的落后和對結核病認識的欠缺，導致結核病在新疆地區(qū)呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢[13-14]。北疆地區(qū)屬于人口相對稠密地區(qū)，做好北疆地區(qū)的結核分枝桿菌分型和耐藥檢測工作，對于控制北疆地區(qū)結核病的傳播、預防及治療具有重大意義。

志謝 感謝新疆胸科醫(yī)院和新疆石河子第二人民醫(yī)院的專家為本研究提供了菌株和相應的指導；同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院 上海市結核(肺)重點實驗室提供研究平臺，以及實驗室各位專家的悉心指導和幫助

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(本文編輯：范永德)

Genotyping and drug resistance analysis ofMycobacteriumtuberculosisin the northern regions of Xinjiang province

BAOHai-yang*,CAOXu-dong,QINLian-hua,YANGHua,WUChang-xin,LIUZhong-hua,CHENChuang-fu.

*CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China

s:CHENChuang-fu,Email:ccf-xb@163.com;LIUZhong-hua,Email:nllzh@126.com

Objective To study the relationship between different genotypes and drug-resistance inMycobacteriumtuberculosisand analyze molecular epidemiological characteristics. Methods One hundred and fourteenMycobacteriumtuberculosisclinical isolates were collected in the northern regions of Xinjiang province. Their genotypes were analyzed by spoligotyping and drug susceptibility was assessed using the proportion method. NTsys 2.10e software was used to perform cluster analysis. Results There were 66 different genotypes among the 114Mycobacteriumtuberculosisisolates. Seventy-one (62.28%) isolates belonged to the Beijing genotype and 43 (37.72%) to non-Beijing genotypes. The isolates divided into two clusters (A and B), with 34 in the A cluster, 11.77% (4/34) of which were Beijing genotypes, 88.23% (30/34) of which were non-Beijing genotypes; 80 in the B cluster, of which 83.75% (67/80) were Beijing genotype isolates, and 16.25% (13/80) were Beijing genotypes. The drug-resistance rate among the 114Mycobacteriumtuberculosisisolates was 40.35% (46/114), with 19.3% (22/114) of the isolates being multidrug resistance (MDR). The drug-resistance rate of Beijing genotype isolates was 42.25% (30/71), while that of non-Beijing genotype isolates was 37.21% (16/43) (χ2=0.28,P=0.60). Of the drug-resistant Beijing genotype isolates, 22.54% (16/71) were multidrug resistant. ConclusionMycobacteriumtuberculosisisolates from the northern regions of Xinjiang province showed marked polymorphisms, with the main epidemic genotype being the Beijing genotype. Both Beijing and non-Beijing genotypes showed significantly high rates of drug-resistance.

Mycobacteriumtuberculosis; Genotype; Drug resistance, bacterial

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.02.008

國家自然科學基金(81201253,31060333)；上海市衛(wèi)生局課題(20124200)；“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003003-002)；國家科技部重大專項(2012CB518706)

832003 新疆維吾爾自治區(qū)石河子大學動物科技學院(包海洋、陳創(chuàng)夫)，醫(yī)學院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室(曹旭東、吳長新)；同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院 上海市結核病(肺)重點實驗室(秦蓮花、楊華、劉忠華)

陳創(chuàng)夫，Email：ccf-xb@163.com；劉忠華，Email：nllzh@126.com

2015-09-11)