耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變特征分析

孟慶琳 王玉峰 逄宇 趙雁林

?

·論著·

耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變特征分析

孟慶琳 王玉峰 逄宇 趙雁林

目的 分析耐多藥結(jié)核分枝桿菌不同基因型構(gòu)成以及耐藥相關(guān)基因突變特征。方法 2007年全國耐藥基線調(diào)查共收集結(jié)核分枝桿菌臨床分離株4017株，經(jīng)比例法藥物敏感性試驗鑒定獲得376株耐多藥菌株納入本研究。采用RD105缺失基因檢測法鑒定北京基因型菌株和非北京基因型菌株。對所有耐多藥菌株利福平耐藥相關(guān)基因(rpoB) 和異煙肼耐藥相關(guān)基因(katG,inhA和oxyR-ahpC)進行測序，分析耐藥相關(guān)基因突變的特征。結(jié)果 在376株耐多藥菌株中，有261株 (69.4%, 261/376)屬于北京基因型，其余115株(30.6%, 115/376)屬于非北京基因型。北京基因型菌株中氧氟沙星耐藥率(31.8%，83/261)和前廣泛耐藥率(30.7%，80/261)明顯高于非北京基因型菌株的氧氟沙星耐藥率(17.4%，20/115)和前廣泛耐藥率(15.7%，18/115)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為8.33和9.32，P值均<0.05)。比較北京基因型菌株和非北京基因型菌株不同位點的突變頻率，發(fā)現(xiàn)北京基因型菌株rpoB基因第531位點 (67.4%, 176/261)和katG基因(66.3%, 173/261)的突變頻率明顯高于非北京基因型 (rpoB：54.1%, 62/115,χ2=6.28，P=0.010；katG：50.4%, 58/115,χ2=8.46，P=0.000)，而非北京基因型菌株未發(fā)生rpoB基因突變的菌株比例(14.8%, 17/115)明顯高于北京基因型菌株(1.1%, 3/261),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.46,P=0.000)。 結(jié)論 北京基因型耐多藥菌株與氧氟沙星耐藥高度相關(guān)，與非北京基因型耐多藥菌株相比，rpoB基因的第531位點和katG基因突變更多發(fā)生于北京基因型菌株中。

結(jié)核分枝桿菌； 抗藥性，多種，細菌； 基因型

中國是耐多藥結(jié)核病負擔最嚴重的國家之一，全球約1/4的耐多藥結(jié)核病患者來自中國[1-2]。2007年開展的一項耐藥基線調(diào)查顯示，結(jié)核病初治患者和復(fù)治患者中耐多藥發(fā)生率分別為5.7%和25.6%[3]。因此，如何有效控制耐多藥結(jié)核病的傳播是中國面臨的重大公共衛(wèi)生問題。

耐多藥結(jié)核病的診斷通常依據(jù)傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗，由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，傳統(tǒng)藥敏試驗通常需要3個月時間，因此延誤了患者的早期診斷和治療，同時，可能導(dǎo)致耐多藥結(jié)核分枝桿菌在人群中的傳播[4]。隨著全基因組測序技術(shù)的發(fā)展，一系列耐多藥結(jié)核病的分子生物學(xué)檢測技術(shù)不斷問世[4]，但是這些技術(shù)的應(yīng)用依賴于對耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變特征的了解。然而，目前我國尚缺乏具有代表性的耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變特征分析的研究。本研究選取我國耐藥基線調(diào)查鑒定的耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株，采用RD105缺失基因檢測法鑒定結(jié)核分枝桿菌“北京家族”菌株，同時，對利福平和異煙肼耐藥相關(guān)基因進行測序分析。

材料和方法

一、 菌株來源

本實驗選取376株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株，菌株由中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室提供，來自于2007年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查[5]。按照流行病學(xué)抽樣原則，在全國31個省、市、自治區(qū)(直轄市)進行結(jié)核病耐藥基線調(diào)查，選點數(shù)量根據(jù)2005年全年新發(fā)涂陽肺結(jié)核患者例數(shù)為基礎(chǔ)計算獲得，總計收集到4017株臨床分離結(jié)核分枝桿菌菌株，上述菌株經(jīng)過傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗以及對硝苯甲酸(PNB)和噻吩二羧酸肼(TCH)菌種鑒定，共鑒定獲得376株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株。標準菌株H37Rv為國家結(jié)核病參比實驗室保藏菌株。

二、定義

相關(guān)定義如下：(1)耐多藥結(jié)核分枝桿菌：至少對異煙肼和利福平同時耐藥的菌株；(2)前廣泛耐藥(pre-XDR)：對氧氟沙星或卡那霉素一種耐藥但不同時耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌；(3)廣泛耐藥(XDR)：同時對氧氟沙星和卡那霉素耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌[1]；(4)初治患者：既往未經(jīng)抗結(jié)核治療，或抗結(jié)核治療時間少于1個月；(5)復(fù)治患者：既往抗結(jié)核治療時間大于1個月。

三、 試劑來源

本試驗所用改良羅氏培養(yǎng)基購自杭州嘉偉生物制品有限公司；2×Taq預(yù)混液購自北京康為世紀生物科技有限公司；所有引物均由北京天一輝遠生物技術(shù)有限公司合成。

四、基因組DNA提取

采用簡單法提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA[5]。采用無菌生理鹽水清洗羅氏培養(yǎng)基斜面生長的菌落, 吸取菌懸液1 ml于無菌離心管中, 80 ℃ 30 min 滅活, 12 000×g離心5 min，去上清。菌體沉淀用500 μl Tris-EDTA(TE)緩沖液(pH 8. 0) 充分懸浮, 95 ℃水浴30 min, 12 000 ×g離心5 min，取上清即為PCR擴增模板。

五、北京基因型菌株的鑒定

采用RD105缺失基因檢測法鑒定北京基因型菌株[6]，引物及探針序列：上游引物：5′-AACGAACTGCGCACTGAACTC-3′；下游引物：5′-TCCCGCACCGGTTGAG-3′；熒光探針：5′-FAM-AGAGTGGACAGTTTCG-BHQ1-3′。 擴增體系：2×Taq預(yù)混液25 μl，兩條引物和探針各0.2 μmol，5 μl基因組DNA。反應(yīng)條件: 預(yù)變性94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，40個循環(huán); 72 ℃ 延伸10 min。其中，有RD105區(qū)域擴增曲線的定義為非北京基因型菌株，無RD105區(qū)域擴增曲線的定義為北京基因型菌株。

六、基因擴增和測序

如表1所示合成引物，分別擴增利福平耐藥相關(guān)基因rpoB，以及異煙肼耐藥相關(guān)基因inhA、katG、oxyR-ahpC[7]。擴增體系：2×Taq預(yù)混液25 μl，兩條引物各0.2 μmol，5 μl基因組DNA。反應(yīng)條件: 預(yù)變性94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min 35個循環(huán); 72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果采用在線軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與標準敏感株H37Rv基因序列進行比對。

表1 本研究所使用的測序引物序列及產(chǎn)物大小

六、 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，對北京基因型菌株和非北京基因型菌株耐藥率、不同人群特征分布情況、不同基因型突變情況進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同基因型菌株耐藥情況及特征分布

在376株耐多藥菌株中，有261株 (69.4%)屬于北京基因型，其余115株(30.6%)屬于非北京基因型。進一步比較不同基因型菌株的耐藥率以及特征，結(jié)果表明，北京基因型菌株中氧氟沙星耐藥率(31.8%，83/261)和前廣泛耐藥率(30.7%，80/261)明顯高于非北京基因型菌株的氧氟沙星耐藥率(17.4%，20/115)和前廣泛耐藥率(15.7%，18/115)，(χ2值分別為8.33和9.32，P值均<0.05)。此外，北京基因型和非北京基因型菌株在人群特征方面分布情況見表2，對抗結(jié)核藥物耐藥情況見表3。

表2 北京基因型菌株和非北京基因型菌株在不同人群特征間的分布情況

注 括號外數(shù)值為“耐藥菌株數(shù)(株)”，括號內(nèi)數(shù)值為“耐藥率(%)”

表3 抗結(jié)核藥物在北京基因型和非北京基因型菌株中的耐藥情況

注 括號外數(shù)值為“耐藥菌株數(shù)(株)”，括號內(nèi)數(shù)值為“耐藥率(%)”；前廣泛耐藥定義為對氧氟沙星或卡那霉素中的一種耐藥，但不同時耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌；廣泛耐藥定義為同時對氧氟沙星和卡那霉素耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌

二、 利福平耐藥相關(guān)基因突變特征分布

在376株耐多藥菌株中，總計有356株(94.7%，356/376)檢測到在利福平耐藥相關(guān)基因rpoB發(fā)生基因突變。其中，最常見的突變發(fā)生在第531位點，包括238株(63.3%，238/376)，上述突變導(dǎo)致絲氨酸突變?yōu)榱涟彼岬挠?27株(60.4%，227/376)，突變?yōu)樯彼岬挠?0株(2.7%, 10/376)，突變?yōu)槔野彼岬挠?株(0.3%，1/376)。除了第531位點突變，排在第2位的突變發(fā)生在第526位氨基酸, 有69株，約占全部菌株的18.4%(69/376)。此外，還有25株突變發(fā)生在第516位點，8株在第511位點，3株在第513位點, 9株在第515位點, 2株在第522位點，2株在第533位點。比較北京基因型菌株和非北京基因型菌株中不同位點的突變頻率，發(fā)現(xiàn)北京基因型菌株第531位點突變頻率(67.4%，176/261)明顯高于非北京基因型菌株(54.1%, 62/115)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.28，P=0.010)。與之相反，非北京基因型菌株中未發(fā)生rpoB基因突變的菌株(14.8%, 17/115)明顯高于北京基因型菌株(1.1%, 3/261),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.46，P=0.000)，見表4。

表4 rpoB基因在北京基因型和非北京基因型耐多藥菌株中的突變情況

注 表格中括號外數(shù)值為“突變菌株數(shù)(株)”，括號內(nèi)數(shù)值為“突變率(%)”；“—”：由于樣本數(shù)量中有一個實際頻數(shù)為0，因此未進行統(tǒng)計學(xué)分析； Leu：亮氨酸；Pro：脯氨酸；Gln：谷氨酰胺； Met：蛋氨酸； Ile：異亮氨酸；Phe：苯丙氨酸；Asp：天冬氨酸；Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Gly：甘氨酸；Tyr：酪氨酸；Val：纈氨酸；Ser：絲氨酸；His：組氨酸；Arg：精氨酸；Trp：色氨酸

三、 異煙肼耐藥相關(guān)基因突變特征分布

376株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株中分別有231株(61.4%， 231/376)攜帶katG基因突變，67株(17.8%，67/376)攜帶inhA基因突變，48株(12.8%, 48/376)攜帶oxyR-ahpC基因突變。其中，最常見的突變發(fā)生在katG基因的第315位絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸，總計208株(55.3%)。此外，在第315位點，有16株菌株突變?yōu)樘於０罚?株突變?yōu)楫惲涟彼?。在對inhA啟動子區(qū)域及oxyR-ahpC間隔區(qū)的序列分析中，發(fā)現(xiàn)67株(17.8%)帶有inhA突變，其中48株(12.8%)為第-15位點突變；此外，還有48株(12.8%)耐多藥菌株oxyR-ahpC區(qū)域發(fā)生突變，上述區(qū)域中最常見核酸突變?yōu)?12C/T 和-10C/T，分別有13株(3.5%) 和9株 (2.4%)。北京基因型耐多藥菌株(66.3%)帶有katG基因突變的頻率明顯高于非北京基因型菌株(50.4%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.46,P=0.000)。而北京基因型和非北京基因型菌株inhA啟動子區(qū)域突變的頻率分別為17.2%和19.1%;oxyR-ahpC間隔區(qū)域突變的頻率分別為12.3% 和13.9%，兩種基因型分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表5。

表5 inhA，katG和oxyR-ahpC基因在北京基因型和非北京基因型菌株中的突變情況

注 表格中括號外數(shù)值為“突變菌株數(shù)(株)”，括號內(nèi)數(shù)值為“突變率(%)”；Gly：甘氨酸；Ser：絲氨酸；Asn：天冬酰胺；Ile：異亮氨酸；Thr：蘇氨酸

討 論

北京基因型菌株是全世界范圍內(nèi)傳播范圍最廣的結(jié)核分枝桿菌家族，特別是在東亞、南非以及歐亞大陸北部地區(qū)[5]。多篇在中國不同地區(qū)進行的研究表明，北京基因型仍是我國耐多藥結(jié)核分枝桿菌主要基因型，然而不同地區(qū)耐多藥菌株中北京基因型的比例為73.3%～93.3%[7-9]。許多研究表明，北京基因型與耐藥相關(guān)，這種特性增加了北京基因型菌株在選擇壓力下的適應(yīng)性[10]。與之相反，也有流行病學(xué)研究結(jié)果表明，北京基因型菌株與非北京基因型菌株在耐藥方面無差異[11]。本研究結(jié)果顯示，北京基因型耐多藥菌株氧氟沙星耐藥率和前廣泛耐藥率明顯高于非北京基因型菌株。

臨床結(jié)核分枝桿菌菌株對利福平的耐藥性主要歸因于rpoB基因的耐藥決定區(qū)發(fā)生突變[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，94.7%的耐多藥菌株帶有rpoB基因突變。其中，最常見的突變發(fā)生于第531位點(63.3%)，與印度(59.0%), 尼泊爾(58.7%)和中國不同地區(qū) (58.3%～61.2%)研究類似[13-14]。此外，來自于德國和俄羅斯的研究表明，北京基因型菌株第531位點突變的頻率明顯高于非北京基因型菌株，本研究也取得類似發(fā)現(xiàn)。同時，我們也發(fā)現(xiàn)非北京基因型菌株未發(fā)生rpoB基因突變的比例明顯高于北京基因型菌株[15-16]。

Pang 等[17]研究表明，異煙肼耐藥突變主要發(fā)生在katG基因和inhA的啟動子區(qū)域。本研究中最常見的異煙肼突變發(fā)生在katG基因的第315位點(61.4%)，其突變頻率與江西省(65.8%)和上海市(72.7%)的研究結(jié)果類似，而低于俄羅斯(93.6%)和福建省(82.7%)[7-8,16]。此外，oxyR-ahpC間隔區(qū)的突變也與異煙肼耐藥相關(guān)。然而，通常認為該突變在異煙肼耐藥菌株中發(fā)生頻率較低或者伴隨katG315位點同時出現(xiàn)[7]。但是本研究結(jié)果表明，8.2%的耐多藥菌株僅在oxyR-ahpC區(qū)域發(fā)生了點突變。近年來，多個耐多藥結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒均通過對katG基因和inhA的啟動子區(qū)域的檢測判斷異煙肼耐藥性[17]，基于本研究發(fā)現(xiàn)，上述產(chǎn)品可能僅能從我國耐多藥結(jié)核分枝桿菌患者中發(fā)現(xiàn)約75%的異煙肼耐藥患者。本研究結(jié)果提示，應(yīng)當將oxyR-ahpC間隔區(qū)納入我國異煙肼耐藥快速檢測產(chǎn)品中，以提高其敏感度。

[1] 姜世聞, 胡屹, 張慧, 等. 耐藥結(jié)核病的流行簡況. 中國防癆雜志, 2010, 32(6): 351-353.

[2] World Health Organization. Global tuberculosis report 2014. Geneva: World Health Organization, 2014.

[3] 王勝芬, 趙冰, 宋媛媛, 等. 我國耐藥結(jié)核病的危險因素—2007年全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查資料分析. 中國防癆雜志, 2013, 35(4): 221-226.

[4] 申曉娜, 趙雁林, 肖和平. 結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性表型檢測的研究進展. 中國防癆雜志, 2013, 35(6): 463-467.

[5] 逄宇, 夏輝, 姜廣路, 等. 中國結(jié)核分枝桿菌寡核苷酸基因分型及其耐藥性分析. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 34(11): 1023-1028.

[6] Liang QF, Pang Y, Chen QY, et al. Genetic profile of tuberculosis among the migrant population in Fujian Province, China. Int J Tuberc Lung Dis, 2013, 17(5): 655-661.

[7] Chen Q, Pang Y, Liang Q, et al. Molecular characteristics of MDRMycobacteriumtuberculosisstrains isolated in Fujian, China. Tuberculosis (Edinb), 2014, 94(2): 159-161.

[8] Zhao M, Li X, Xu P, et al. Transmission of MDR and XDR Tuberculosis in Shanghai， China.PLoS One, 2009, 4(2): e4370.

[9] Yuan X, Zhang T, Kawakami K, et al. Genotyping and clinical characteristics of multidrug and extensively drug-resistant tuberculosis in a tertiary care tuberculosis hospital in China. BMC Infect Dis, 2013, 13: 315.

[10] Almeida D, Rodrigues C, Ashavaid TF, et al. High incidence of the Beijing genotype among multidrug-resistant isolates ofMycobacteriumtuberculosisin a tertiary care center in Mumbai, India.Clin Infect Dis, 2005, 40(6): 881-886.

[11] Zhang Z, Lu J, Wang Y, et al. Prevalence and molecular charac-terization of fluoroquinolone-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates in China. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(1): 364-369.

[12] 逄宇, 李桂蓮, 王玉峰, 等. 單耐利福平結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機制研究. 中國防癆雜志, 2012, 34(5): 275-279.

[13] Poudel A, Nakajima C, Fukushima Y, et al. Molecular charac-terization of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolated in Nepal. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(6): 2831-2836.

[14] Suresh N, Singh UB, Arora J, et al.rpoBgene sequencing and spoligotyping of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from India. Infect Genet Evol, 2006, 6(6): 474-483.

[15] Hillemann D, Kubica T, Rüsch-Gerdes S, et al. Disequilibrium in distribution of resistance mutations amongMycobacteriumtuberculosisBeijing and non-Beijing strains isolated from patients in Germany. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(3): 1229-1231.

[16] Lipin MY, Stepanshina VN, Shemyakin IG, et al. Association of specific mutations inkatG,rpoB,rpsLandrrsgenes with spoligotypes of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates in Russia. Clin Microbiol Infect, 2007, 13(6): 620-626.

[17] Pang Y, Xia H, Zhang Z, et al. Multicenter evaluation of genechip for detection of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis. J Clin Microbiol, 2013, 51(6): 1707-1713.

(本文編輯：王然 李敬文)

Analysis on drug resistance-associated mutation among multi-drug resistant tuberculosis strains in China

MENGQing-lin,WANGYu-feng,PANGYu，ZHAOYan-lin.

NationalCenterforTuberculosisControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To explore the population structure of multidrug-resistant (MDR) tuberculosis strains and distribution of resistance-associated nucleotide alteration among the MDR strains classified as different genotypes in China. Methods A total of 4017Mycobacteriumtuberculosisisolates were collected from the national drug resis-tance survey of China in 2007. By the proportional method for drug susceptibility testing, 376 isolates identified as MDR isolates were enrolled in this study. The RD105 deletion-targeted multiplex PCR method was used to distinguish the Beijing genotype and non-Beijing genotypes amongst 376 MDR strains. In addition, all the MDR isolates were sequenced for genetic mutations conferring rifampicin (rpoB) and isonizid resistance (katG,inhAandoxyR-ahpC). Results Out of the 376 MDR isolates, 261 (69.4%, 261/376) belonged to Beijing genotype, while the other 115 (30.6%, 115/376) were non-Beijing genotype. The Beijing MDR strains had significantly higher proportions of ofloxacin-resistant (Beijingvs. non-Beijing: 31.8%, 83/261vs. 17.4%, 20/115) and pre-XDR isolates (Beijingvs. non-Beijing: 30.7%, 80/261vs. 15.7%, 18/115) than non-Beijing strains (χ2=8.33, 9.32, allPvalues <0.05). When compared with mutation frequency of different mutant types between Beijing genotype and non-Beijing genotype, the proportion of MDR isolates harboring codon 531 mutation (67.4%, 176/261) andkatGmutation (66.3%, 173/261) among Beijing genotype strains was significantly lower than that of non-Beijing genotype (rpoB：54.1%, 62/115,χ2=6.28,P=0.010；katG：50.4%,58/115,χ2=8.46，P=0.000), while non-Beijing genotype (14.8%, 17/115) showed stronger association with isolates lacking mutation in rifampicin resistance determination region (1.1%,3/261,χ2=29.46,P=0.000). Conclusion In conclusion, Beijing genotype MDR strains revealed a significant association with ofloxacin-resistance. In addition, therpoB531 andkatGmutation was more frequently observed among Beijing genotype strains than non-Beijing strains.

Mycobacteriumtuberculosis; Drug resitance,multiple,baterial; Genotype

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.02.009

“十二五”國家重大科技專項(2013ZX10003003)；國家自然科學(xué)基金(81301509)

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2015-08-22)