肖　燕，陳莉萍，陳玲琳，何　興，何宇新

(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

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·生物工程·

生脈處方小鼠抗應(yīng)激試驗(yàn)及最佳提取工藝

肖燕，陳莉萍，陳玲琳，何興，何宇新*

(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

摘要：研究生脈處方不同提取方式的提取液藥效差異，確定最優(yōu)提取工藝。以人參皂苷Rg1、Re含量，干膏收率，小鼠抗應(yīng)激反應(yīng)試驗(yàn)藥效差異，比較生脈處方提取方式差異，再根據(jù)實(shí)際選擇適宜提取方法；通過正交試驗(yàn)與驗(yàn)證，結(jié)合HPLC法含量測定，確定所選提取方法的最佳提取工藝。結(jié)果表明：生脈醇提1與生脈醇提2相比較，在小鼠的常壓耐缺氧試驗(yàn)、游泳試驗(yàn)下，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均無顯著差異，但是與生理鹽水組比較，生脈醇提組中、大劑量都具有顯著差異；主藥含量及干膏收率生脈醇提2均高于生脈醇提1；確定提取方法為直接乙醇回流提取，因素由主到次為ACDB，即影響因素由大到小順序?yàn)橐掖急读?提取次數(shù)>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間，最佳組合為A3C3D2B1,根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際優(yōu)化提取條件為A2C3D2B2，驗(yàn)證試驗(yàn)穩(wěn)定可靠，最終確定醇提條件為65 %乙醇8倍量回流提取3次，每次1.5 h?？芍}制劑的五味子揮發(fā)油工藝可選擇性省去，以簡化工藝步驟，具有社會性與經(jīng)濟(jì)性意義，可為解決生產(chǎn)實(shí)際問題和后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：生脈；提取工藝；抗應(yīng)激試驗(yàn)

生脈散起源于《內(nèi)外傷辨惑論》，以人參、麥冬、五味子為方，具有益氣生津，斂陰止汗的功效，療效顯著，是中醫(yī)治療氣陰兩虛證的基本方[1]?，F(xiàn)代生脈制劑是以這3味藥材為基加減配方，運(yùn)用現(xiàn)代提取工藝制成，具有辨證論治、隨證加減的優(yōu)點(diǎn)，又克服了湯劑煎湯麻煩、保存不便的缺點(diǎn)[1-2]。經(jīng)查找相關(guān)文獻(xiàn)，已有成熟標(biāo)準(zhǔn)的生脈制劑提取方法有水煎煮法、水提純沉法、乙醇滲漉法與回流提取法，部分醇提法涵括水蒸氣蒸餾提取五味子揮發(fā)油并進(jìn)行包合[3-5]等工藝，耗時(shí)耗能，乳化嚴(yán)重，提取率低，在大工藝生產(chǎn)中尤為顯著。五味子揮發(fā)油藥理藥效報(bào)道中，其主要藥效為鎮(zhèn)咳，并無相關(guān)文獻(xiàn)對其在生脈制劑中的揮發(fā)油提取必要性進(jìn)行對比研究；因此筆者對生脈制劑中五味子揮發(fā)油提取必要性進(jìn)行初步抗應(yīng)激藥效及主要有效成分含量變化考察，并比較、優(yōu)選最佳提取工藝，以期簡化工藝步驟，在保證療效的前提下，為生脈制劑適宜實(shí)際生產(chǎn)等問題提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1儀器與材料

儀器：Waters e2695-2487高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Sartorius BT 125D電子天平(鶴壁市鑫運(yùn)儀器設(shè)備有限公司)；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠) ；KQ超聲波清洗儀(東莞嘉勁機(jī)械有限公司)。

藥效試驗(yàn)提取液：水提生脈散(含生藥約0.65 g·mL-1)、醇提生脈散1(揮發(fā)油包合[3-4]，含生藥約0.65 g·mL-1)、醇提生脈散2(直接提取，含生藥約0.97 g·mL-1)。藥液組提取工藝為：藥材240 g；溶媒純水、65 %乙醇；第1次8倍量1.5 h，第2次6倍量1 h，第3次4倍量1 h提??；濾過后濃縮至相對密度(60 ℃)1.1～1.2，定容至250 mL而得。參照文獻(xiàn)[3-4]進(jìn)行揮發(fā)油提取包合。

試劑：人參皂苷對照品Rg1、Re(中國藥品生物制品檢定研究院，批號：110703-201128；110754-200822)，甲醇、乙腈為HPLC純，超純水，磷酸、正丁醇為分析純。

動物：健康KM小鼠(由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量(20±2) g，雌雄各半。在溫度為(22±2) ℃，濕度40 %～60 %，12 h光照交替的環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料、攝水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱：Cromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長203 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。流動相：乙腈-0.1 %磷酸溶液(21∶79)[6]。系統(tǒng)適用性：以人參皂苷對照品Rg1色譜峰計(jì)，理論塔板數(shù)不小于6 000。

1.2.2溶液配制

對照品混合溶液：取人參皂苷Rg1、Re對照品適量，精密稱定，加甲醇稀釋定容制成每1 mL各含0.25 mg的混合對照溶液，冷藏備用[7]。

供試藥液的制備：各量取待測提取藥液10 mL，加水飽和正丁醇振搖提取4次(15、15、10、10 mL)；合并正丁醇提取液，瓷坩堝內(nèi)水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶，瓷坩堝用甲醇淌洗3次，轉(zhuǎn)移至量瓶用甲醇稀釋定容[7]，備用；進(jìn)樣前用0.45 μm有機(jī)微孔濾器濾過，進(jìn)樣10 μL于色譜系統(tǒng)進(jìn)行主要有效成分測定。

1.2.3方法學(xué)考察

按照上述方法配制混合對照溶液，于HPLC進(jìn)樣記錄系統(tǒng)適應(yīng)性，根據(jù)要求適當(dāng)調(diào)節(jié)流動相比例至所記錄的色譜圖滿足規(guī)定的理論踏板數(shù)要求。

1)系統(tǒng)適應(yīng)性與線性關(guān)系試驗(yàn)。根據(jù)適應(yīng)性要求取對照溶液進(jìn)樣，調(diào)整色譜系統(tǒng)以使理論踏板符合要求；再重復(fù)進(jìn)樣混合對照溶液，記錄系列進(jìn)樣體積下的色譜結(jié)果，以峰面積對進(jìn)樣量作線性回歸曲線并得出回歸方程，以考察線性相關(guān)性是否良好。

2)精密度與穩(wěn)定性考察。取上述對照品混合溶液，記錄不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣的色譜結(jié)果，并分析各次進(jìn)樣峰面積的RSD值；再取對照品混合溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣得到色譜結(jié)果，計(jì)算RSD值，以判斷所用實(shí)驗(yàn)條件是否良好。

1.2.4藥物組提取液干膏收率及主藥含量測定

1)主要含量測定：按照1.2.2節(jié)所述方法制備待測供試樣品溶液后，采用系統(tǒng)適應(yīng)性下相同色譜方法，精密進(jìn)樣并記錄主藥有效成分峰面積。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前單個GenBank數(shù)據(jù)庫中的流感數(shù)據(jù)就超過25萬條，并且這個數(shù)據(jù)隨著時(shí)間的推移，將不斷增長。病毒序列的字段信息一般由數(shù)千個字符組成，最長可達(dá)百萬個字符。為降低單個數(shù)據(jù)表的大小，這里將各種序列信息單列成為與其基本表關(guān)聯(lián)的單表。

2)干膏收率：取空坩堝于105 ℃烘干至恒重，記錄恒重的空坩堝質(zhì)量m。量取一定體積待測提取藥液于恒重的空坩堝，置于水浴鍋蒸干；再放入105 ℃烘箱烘干約5～6 h,取出放入干燥器約20 min，稱量并記錄稱量數(shù)據(jù)，再多次重復(fù)直至恒重(兩次稱重差異小于0.003 g)，記錄最后稱重?cái)?shù)據(jù)M；干膏收率為(M-m)×定容體積/(取用體積×生藥量)×100%。

1.2.5小鼠抗應(yīng)激反應(yīng)藥效試驗(yàn)

1)對小鼠常壓耐缺氧時(shí)間影響試驗(yàn)。給藥結(jié)束6 h后，按每瓶1只將小鼠分別放入250 mL廣口瓶內(nèi)(內(nèi)裝25 g鈉石灰)，以凡士林密封瓶口，加蓋立即計(jì)時(shí)，直至小鼠呼吸停止[8-10]。以小鼠在廣口瓶內(nèi)窒息時(shí)間作為耐缺氧時(shí)間，比較供試組小鼠耐缺氧時(shí)間差異[9-10]，以生理鹽水作空白對照。

2)對小鼠游泳時(shí)間的影響試驗(yàn)。將小鼠放入室溫28 ℃，水溫18 ℃，90 cm×45 cm×30 cm深水池中游泳，記錄小鼠放入水池游泳至鼻子不能露出水面游不動并開始下沉的時(shí)間。

1.2.6優(yōu)選提取方法下的最佳提取工藝試驗(yàn)

處方比例：人參∶麥冬∶五味子=3∶3∶2(質(zhì)量比)。由抗應(yīng)激藥效試驗(yàn)確定采用的提取方法：乙醇直接回流提取，藥材粉碎過10目。參照藥典標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，選定提取因素為：乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇倍量、提取次數(shù)設(shè)計(jì)因素水平表，L9(34)如表1所示。選用干膏收率和人參皂苷Rg1、Re含量作為評價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別按0.4、0.6來計(jì)算，確定最優(yōu)提取工藝。再對優(yōu)化的最佳工藝條件驗(yàn)證，進(jìn)行3次重復(fù)提取，以考察工藝穩(wěn)定性。

表1　乙醇回流提取工藝因素水平表

2結(jié)果與討論

2.1系統(tǒng)適應(yīng)性與方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1色譜系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果與線性關(guān)系結(jié)果

試驗(yàn)所用色譜系統(tǒng)，在符合理論塔板數(shù)要求的前提下，要保證盡可能大的分離度，而保留時(shí)間又不至于太長，最終調(diào)整流動相比例為21∶79，得到系統(tǒng)適應(yīng)性理論塔板數(shù)均為規(guī)定數(shù)的2倍以上，遠(yuǎn)高于6 000，如表2所示。

用峰面積對進(jìn)樣量作線性回歸，得到人參皂苷Rg1在0.392～2.352 μg與峰面積線性方程為y=105x+4 257.7,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，R=0.999 7；人參皂苷Re在0.4～2.4 μg與峰面積線性方程為y=69 403x-5 748.6,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。說明對照品在該方法系統(tǒng)下，各自進(jìn)樣量范圍內(nèi)均具有較好的線性相關(guān)性，條件可靠穩(wěn)定，如表3所示。

表2　色譜系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果

表3　線性關(guān)系考察

2.1.2對照品穩(wěn)定性試驗(yàn)與精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2藥物組提取液干膏收率及主藥含量結(jié)果分析

由表5干膏收率得知，水提方法干膏收率高，因?yàn)槟z質(zhì)、鞣質(zhì)類水溶性雜質(zhì)成分較多，有效成分提取率低，由主藥色譜峰高很低可知，也證實(shí)文獻(xiàn)相關(guān)報(bào)道的醇提優(yōu)于水提的結(jié)論。醇提2總體優(yōu)于醇提1，干膏收率合適，主藥含量Rg1高，Re略低，確定生脈處方適宜提取方法為直接乙醇回流提取，五味子揮發(fā)油提取步驟可省去，簡化工藝流程。

2.3小鼠抗應(yīng)激反應(yīng)藥效試驗(yàn)結(jié)果分析

由提取揮發(fā)油并包合制成的生脈提取液與直接提取的生脈醇提液的小鼠抗應(yīng)激反應(yīng)藥效試驗(yàn)(結(jié)果見表6)可知：試驗(yàn)藥物組中、高劑量與陰性對照組有明顯統(tǒng)計(jì)差異，說明藥物具有耐缺氧，提高耐力作用；劑量組由小到大，中劑量優(yōu)于小劑量，高劑量略高于或低于中劑量，可能高劑量使小鼠適應(yīng)性不良或劑量超過正常承受導(dǎo)致不良反應(yīng)所致；醇提1與醇提2在小鼠的耐缺氧試驗(yàn)、游泳試驗(yàn)比較下，時(shí)間亦無明顯差異，醇提2稍優(yōu)于醇提1。以簡化生產(chǎn)工藝操作又不失藥效作用為前提，可以考慮合并五味子共提，省去揮發(fā)油提取包合步驟。

2.4醇提工藝最佳條件試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表7可知，以極差大小確定因素主次為ACDB，即乙醇倍量>提取次數(shù)>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間。按評分最高為優(yōu)，可得出最優(yōu)組合為A3C3D2B1。綜合各能源生產(chǎn)因素，A2、A3差異不大，為節(jié)約溶劑，選擇A2；乙醇體積分?jǐn)?shù)不是影響最大因素，從節(jié)約成本出發(fā)，選擇B2。因此優(yōu)選出組合A2C3D2B2為最佳提取條件。由最佳工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果(見表8)可知，與表7中最優(yōu)工藝條件所得試驗(yàn)結(jié)果基本一致，本試驗(yàn)中所得最佳提取工藝穩(wěn)定可靠，具有重復(fù)可操作性。最終確定本試驗(yàn)生脈處方最佳醇提工藝為8倍量65%乙醇回流提取3次，每次1.5 h。

表4　穩(wěn)定性與精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5　不同提取方式生脈藥液干膏收率與主藥含量比較

表6　兩種生脈提取液的抗應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果

注：與生理鹽水組對照，抗應(yīng)激試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05具有顯著性差異，標(biāo)注*；P<0.01具有極顯著差異，標(biāo)注**。

表7　醇提工藝最佳條件優(yōu)選結(jié)果

表8　最佳醇提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3結(jié)論

本試驗(yàn)小鼠抗應(yīng)激反應(yīng)藥效對比試驗(yàn)中，生脈制劑與空白生理鹽水組比較有顯著差異，說明生脈制劑可以提高抗應(yīng)激反應(yīng)水平；但揮發(fā)油提取后的生脈制劑與不提揮發(fā)油的生脈制劑無明顯的藥效差異，主要有效成分含量也無明顯差異。據(jù)此生脈制劑中的五味子揮發(fā)油提取包合工藝可根據(jù)適用癥差異辯證選擇，可以簡化工藝步驟，可為解決生決生產(chǎn)實(shí)際問題提供參考。所選出的最優(yōu)提取工藝條件具有一定穩(wěn)定性，可以為后續(xù)放大生產(chǎn)試驗(yàn)以及配方顆粒制劑工藝試驗(yàn)提供參考。

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(編校：葉超)

Research of Shengmai Prescription on Anti-stress Test and Optimum Extraction Technology

XIAO Yan,CHEN Liping,CHEN Linglin,HE Xing,HE Yuxin*

(SchoolofFoodandBioengineering,XihuaUniversity,Chengdu610039China)

Abstract:Objective to investigate the pharmacodynamic action contrast of pulse-activating prescription extracted in different extraction methods and then determine the optimal extraction process. Method 1)content of active ingredients ginsenosides Rg1,Re,dry ointment yield and mouse anti-stress reaction test was conducted to study pharmacodynamic differences between the two alcohol extraction then preferably extraction method was chose;2) orthogonal test and HPLC method were adopted to determine the optimum extraction process of preferred extraction method. Result with alcohol extraction 1 and 2 under normal pressures anti-anoxia ability, swimming test , the content and the reaction were no significantly difference; by comparison of main drug content and dry ointment yield, the content and the reaction of alcohol extraction 2 were higher than that of alcohol extraction 1;extraction method was direct ethanol reflux extraction, influence factors from the main to the secondary was ACDB, namely influence factors in descending order was the amount of ethanol times, extraction times, volume fraction of ethanol and extraction time. The best combination was A3C3D2B1, under actual production condition the optimization was A2C3D2B2, and verification tests results show the stability and reliability, and final extraction process was 8 times the amount of 65% ethanol, extracted three times and 1.5 hours for each time. Conclusion Schisandra volatile oil extraction process of pulse-activating preparation can be selectively eliminated to simplify the whole processing steps with social and economic significance and this work can provide a reference and basis for solving practical problems in production and further study.

Keywords:pulse-activating; extraction process; anti-stress test

doi:10.3969/j.issn.1673-159X.2016.02.014

中圖分類號：R284.1;R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-159X(2016)02-0072-5

*通信作者：何宇新(1976—)，男，教授，博士后，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樘烊凰幬镏苿┘肮δ苄员＝∈称匪幤费芯颗c開發(fā)。E-mail:524225843qq.com.

基金項(xiàng)目：“西華杯”大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目訓(xùn)練計(jì)劃(2014129)。

收稿日期：2015-03-20