孫偉峰，鐘文娟，孫　彬，伍圓明，茍　赟，林泉秀，陳祥貴，劉　義

(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039)

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生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)(酶)改造及設(shè)計(jì)中應(yīng)用的新進(jìn)展

孫偉峰，鐘文娟，孫彬，伍圓明，茍赟，林泉秀，陳祥貴，劉義

(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039)

摘要：蛋白質(zhì)(酶)的改造和設(shè)計(jì)是人類面對(duì)紛繁復(fù)雜自然界的一個(gè)重大挑戰(zhàn)，是自然進(jìn)化的突發(fā)事件，是人類不斷掌握自然規(guī)律的必然結(jié)果，對(duì)人類更深入地了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，促進(jìn)生物蛋白工業(yè)生產(chǎn)具有重大的意義。本文介紹了新型蛋白質(zhì)(酶)改造和設(shè)計(jì)的新思路和實(shí)施過(guò)程，以及目前生物酶改造和設(shè)計(jì)的一些前沿研究團(tuán)隊(duì)和研究成果，以期為生物酶或蛋白質(zhì)的改造與設(shè)計(jì)提供借鑒。

關(guān)鍵詞：生物信息學(xué); 蛋白質(zhì)改造；酶設(shè)計(jì)

從1965年首次獲得溶菌酶(PDB：HEWL)晶體結(jié)構(gòu)開(kāi)始[1]，人類就一直試圖尋找和掌握蛋白質(zhì)(酶)折疊成特定構(gòu)象的奧秘。從DNA水平、蛋白質(zhì)的一級(jí)序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)到高級(jí)結(jié)構(gòu)，人們一直在不斷地探索以求掌握生命的秘密。由于早期研究條件所限，僅能達(dá)到蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)肽的設(shè)計(jì)水平，盡管如此，蛋白質(zhì)(酶)改造和設(shè)計(jì)還是取得了豐碩的成果：研究者從7個(gè)氨基酸序列形成的α-helix出發(fā)，并在此基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)，成功設(shè)計(jì)了(helix-loop-helix- loop-helix)和α/β 折疊等新型蛋白[1]，這些經(jīng)典設(shè)計(jì)方法一直沿用至今；最近Koga等[2]在《Nature》雜志上報(bào)道了關(guān)于設(shè)計(jì)二級(jí)結(jié)構(gòu)α-helix和β-sheet的一般規(guī)律。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和各種算法的迅速發(fā)展，許多優(yōu)秀的軟件(如Metal Search和Dezyme)被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于改造和設(shè)計(jì)新型蛋白質(zhì)(包括改造和設(shè)計(jì)新型金屬蛋白)[1]，而分子力學(xué)和量子化學(xué)的迅猛發(fā)展，為開(kāi)發(fā)更加優(yōu)秀的軟件用于改造和設(shè)計(jì)更為復(fù)雜的蛋白進(jìn)一步創(chuàng)造了條件[3-9]。近年來(lái)，由美國(guó)華盛頓大學(xué)Baker實(shí)驗(yàn)室組織的每年一次的國(guó)際蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)技術(shù)評(píng)估CASP大賽，被稱之為蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方向的“奧林匹克”，鼓勵(lì)和吸引了全世界蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究科研人員的積極參與，新的算法和新型蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法得以不斷開(kāi)發(fā)[10]。在2010年的第九屆全球蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)比賽中，我國(guó)中科院生物物理所蔣太交研究組發(fā)展的Jiang_Assembly蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器獲得佳績(jī)，進(jìn)入了前20名，這標(biāo)志著我國(guó)在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)領(lǐng)域進(jìn)入了世界上游水平[11]。

盡管如此，在涉及新型蛋白質(zhì)(酶)改造和設(shè)計(jì)的諸多領(lǐng)域還有待加強(qiáng)。當(dāng)前合成生物學(xué)和代謝工程已經(jīng)允許我們?cè)O(shè)計(jì)比較精細(xì)的細(xì)胞工廠用于生產(chǎn)人類所需的高價(jià)值的化學(xué)物質(zhì)；但若想真正實(shí)現(xiàn)生物催化的工業(yè)化，高效生物催化劑——酶，特別是人類還未探知的(也可能是自然界本不存在的)酶成為了不可或缺的關(guān)鍵因素，因而無(wú)論是從工業(yè)價(jià)值還是理論價(jià)值來(lái)講，新型酶設(shè)計(jì)都顯得尤為重要。

1傳統(tǒng)蛋白質(zhì)工程在改造和設(shè)計(jì)新型蛋白質(zhì)(酶)過(guò)程中的不足

目前蛋白質(zhì)(酶)改造和設(shè)計(jì)大多指的是傳統(tǒng)概念上的酶設(shè)計(jì)，如通過(guò)點(diǎn)突變、片段優(yōu)化替換等各種傳統(tǒng)蛋白質(zhì)工程手段，或者涉及常規(guī)生物信息學(xué)的分子改造等而獲得新型酶[12]；但是有些酶由于蛋白質(zhì)骨架性質(zhì)不夠優(yōu)良，很難通過(guò)這些傳統(tǒng)手段“點(diǎn)穴式”小修小補(bǔ)而獲得性能改變，或使某些性能得到巨大提升。如多數(shù)D型氨基酸的生產(chǎn)，由于自然界缺乏直接催化的相應(yīng)酶，并且通過(guò)傳統(tǒng)蛋白質(zhì)工程手段很難獲得，只好采用其他酶多步催化“繞路走”的辦法，有時(shí)需要用幾個(gè)酶聯(lián)合催化才能實(shí)現(xiàn)，再加上工序復(fù)雜導(dǎo)致產(chǎn)品得率損失等多種因素，給工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨額成本。如采用海因酶-氨基酸酰胺水解酶2種酶催化法生產(chǎn)D型氨基酸，由于氨甲酰水解酶的活性、穩(wěn)定性較海因酶低，在生產(chǎn)過(guò)程中氨甲酰水解酶成為了限制性因素，導(dǎo)致D型氨基酸產(chǎn)率較低[13]。此外，某些行業(yè)中關(guān)鍵限制性酶的缺乏，限制了其產(chǎn)物的應(yīng)用。如在醫(yī)藥行業(yè)中，默克制藥公司開(kāi)發(fā)的西塔列汀(sitagliptin)是用于治療糖尿病的特效藥，而作為西塔列汀中的活性結(jié)構(gòu)模塊的β-芳香丙氨酸，如果用有機(jī)法合成，產(chǎn)物往往是對(duì)消旋體，這大大制約了這種特效藥的應(yīng)用。盡管如此，目前β-芳香丙氨酸也只能通過(guò)此法生產(chǎn)，因?yàn)樯锩阜ㄒ踩鄙倏梢灾苯哟呋搔?芳香丙氨酸的高活性新型酶種[14]。

雖然目前一些傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)(酶)技術(shù)和相關(guān)的輔助技術(shù)(例如酶工程手段和分子模擬等)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但若想實(shí)現(xiàn)新型的蛋白質(zhì)(酶)，特別是自然界不存在的蛋白質(zhì)(酶)的改造和設(shè)計(jì)，其難度仍然非常大。這主要是由于包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能理論、進(jìn)化理論，蛋白質(zhì)工程手段(點(diǎn)突變技術(shù))、有機(jī)化學(xué)理論、量子化學(xué)理論和計(jì)算機(jī)科學(xué)等在內(nèi)的各學(xué)科的理論和技術(shù)沒(méi)有系統(tǒng)、有機(jī)地融合。例如研究酶催化機(jī)制的文獻(xiàn)雖然比較多，但實(shí)際上大量的研究成果多停留在理論水平。這主要是由于機(jī)制研究對(duì)科學(xué)性嚴(yán)謹(jǐn)性的高要求，酶催化機(jī)制研究往往比較理想化和理論化，與實(shí)際脫節(jié)，從而使得研究過(guò)程付出昂貴的造價(jià)和冗長(zhǎng)的時(shí)間周期[15]，最后研究所得的機(jī)制成果卻很難得以實(shí)際應(yīng)用；因此，多學(xué)科有效融合是克服傳統(tǒng)蛋白質(zhì)(酶)改造和設(shè)計(jì)缺陷的有效途徑之一。

2新型蛋白質(zhì)(酶)的改造和設(shè)計(jì)思路

改造和設(shè)計(jì)新型蛋白質(zhì)(酶)，特別是自然界不存在的全新酶種，需要突破傳統(tǒng)理論的諸多束縛，更要強(qiáng)化多學(xué)科理論和技術(shù)的有效融合。近年來(lái)，生物酶學(xué)理論得到了迅速的發(fā)展，在新型酶的改造和設(shè)計(jì)中，出現(xiàn)了把酶蛋白的折疊fold模式與酶活性中心分離分別加以研究的設(shè)計(jì)思路。該思路把酶的進(jìn)化理論與折疊模式理論有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，指出如果酶活性中心氨基酸與折疊模式(如TIM桶)在進(jìn)化上不存在必然的聯(lián)系，即折疊模式中活性中心氨基酸占有率越低，則這種折疊骨架即為可進(jìn)化的折疊，反之則為不可進(jìn)化的折疊(如二氫葉酸還原酶折疊DHFR)(圖1)。

圖1　可進(jìn)化與不可進(jìn)化折疊模式

生命體如何選擇與特定進(jìn)化功能(活性中心)匹配的蛋白質(zhì)骨架則與其生理功能相關(guān)：如果在生理上蛋白質(zhì)的某種功能要求持續(xù)存在，則支持這種生理功能長(zhǎng)期發(fā)揮穩(wěn)定性作用的蛋白質(zhì)骨架會(huì)被選擇[16-17]。自然界進(jìn)化這一原則表明，可將某一生理(如酶催化)功能關(guān)鍵結(jié)構(gòu)(酶活性中心)安裝在性能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求的蛋白質(zhì)骨架上，實(shí)現(xiàn)可工業(yè)應(yīng)用的新型酶的改造和設(shè)計(jì)。在該理論的指導(dǎo)下，可先提取酶的活性中心theoz -yme(即完成催化反應(yīng)所需的必需氨基酸)，然后將其與決定酶優(yōu)良特性(高穩(wěn)定性、可溶性、高表達(dá)量、耐酸堿等)的蛋白骨架進(jìn)行匹配，最后選擇匹配較好、酶學(xué)屬性更強(qiáng)的新型酶進(jìn)行實(shí)際生產(chǎn)，從而獲得更具工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的新型酶種(圖2)。

圖2　新型酶的改造和設(shè)計(jì)思路

3新型酶的改造和設(shè)計(jì)工具及流程

3.1酶改造和設(shè)計(jì)的常用軟件

隨著各種優(yōu)秀算法、軟件和更廉價(jià)的高配置計(jì)算機(jī)服務(wù)器的出現(xiàn)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的精度大大提高，為理論和實(shí)踐開(kāi)辟了另一片廣闊的天空。與酶改造和設(shè)計(jì)相關(guān)的模擬軟件有Namd, Discovery Studio、Amber、Autodock、Threader、Pymol、Vmd、Ligandscout、Rosetta、Foldit、Chem3d、Chemdraw、Mopac、Foldx、Triton、Mole和Meme Suite等[18-20]。這些軟件各有側(cè)重，掌握這些軟件的原理和使用方法，不但有助于深刻理解酶學(xué)的各種理論，更有助于減少不必要的實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)的成功率。

3.2新型酶改造和設(shè)計(jì)的Rosetta和Foldit軟件

目前國(guó)際上盛行的蛋白質(zhì)(酶)設(shè)計(jì)軟件是Rosetta和Foldit[21]。這2種軟件涵蓋了蛋白質(zhì)折疊研究、新酶設(shè)計(jì)和抗體識(shí)別設(shè)計(jì)等，同時(shí)也代表了2種不同的蛋白質(zhì)改造和設(shè)計(jì)思想。Rosetta是一種全計(jì)算機(jī)支持的蛋白質(zhì)改造和設(shè)計(jì)軟件，而Foldit是一種基于人腦直覺(jué)的軟件。有時(shí)人腦的一個(gè)簡(jiǎn)單的直覺(jué)，是很難靠計(jì)算機(jī)完成的。Rosetta的成功經(jīng)典案例很多，如：2008年第1個(gè)由Rosetta成功設(shè)計(jì)出可應(yīng)用于生產(chǎn)的Kemp elimination的酶[22]；同年Retro-Aldol (醛縮)酶設(shè)計(jì)成功；2010年Diels-Alder Reaction(雙烯合成)酶也設(shè)計(jì)成功[23]；2012年Khare等用Rosetta第一個(gè)設(shè)計(jì)了用于水解有機(jī)磷的含Zn金屬酶[24]。雖然Rosetta的成功案例逐年增多，但基于人腦直覺(jué)的蛋白質(zhì)Foldit游戲設(shè)計(jì)方法發(fā)展也很迅速。就如同玩游戲般的改造和設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)，不但吸引了全世界蛋白質(zhì)科研愛(ài)好者的廣泛參與，也頻有高水平的研究成果出現(xiàn)。如最近Eiben等利用Foldit游戲玩家的靈感，完成了增強(qiáng)雙烯合成酶活性的研究，相關(guān)成果[25]發(fā)表在Natrue Biotechnology雜志上。

由于Foldit是根據(jù)人腦直覺(jué)進(jìn)行設(shè)計(jì)的，所以沒(méi)有具體的改造和設(shè)計(jì)流程。Rosetta的新酶改造和設(shè)計(jì)有一套比較固定的操作流程：首先通過(guò)分析提取已有或是從頭設(shè)計(jì)某一催化功能活性中心的結(jié)構(gòu)三維模型，利用生物信息學(xué)計(jì)算獲得該三維模型完成催化所必需的各種約束條件；再將該模型裝配到(通過(guò)構(gòu)象搜索到的可匹配的)性能優(yōu)良的蛋白骨架中(如TIM桶)，經(jīng)分子模擬優(yōu)化獲得一系列氨基酸序列；最終通過(guò)微生物高效異源表達(dá)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。與傳統(tǒng)的從序列到結(jié)構(gòu)的改造和設(shè)計(jì)方法相比，Rosetta這種新型改造和設(shè)計(jì)方法是從設(shè)計(jì)底物反應(yīng)到設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)模型到最終序列的逆過(guò)程，由于有大量生物信息學(xué)計(jì)算參與，因而更具靈活性和創(chuàng)造性(圖3)。

圖3　Rosetta新型蛋白質(zhì)(酶)設(shè)計(jì)

4國(guó)際上蛋白質(zhì)(酶)改造和設(shè)計(jì)的前沿團(tuán)隊(duì)

巨大的工業(yè)需要促使國(guó)際知名團(tuán)隊(duì)對(duì)蛋白質(zhì)(酶)改造和設(shè)計(jì)展開(kāi)了深入的研究。1991年Hellinga等[26]利用自己開(kāi)發(fā)的Dezymer蛋白設(shè)計(jì)軟件成功設(shè)計(jì)了一個(gè)類超氧化物歧化酶。目前在此領(lǐng)域較前沿的團(tuán)隊(duì)有美國(guó)華盛頓大學(xué)Baker團(tuán)隊(duì)、美國(guó)普林斯頓大學(xué)Floudas團(tuán)隊(duì)、以色列魏茲曼研究所Tawfik團(tuán)隊(duì)和加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校Florian Richter團(tuán)隊(duì)等。David Baker團(tuán)隊(duì)主要圍繞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、新酶設(shè)計(jì)和抗體設(shè)計(jì)等蛋白質(zhì)方向進(jìn)行研究，目前已在分子模擬、量子化學(xué)計(jì)算、Rosetta軟件設(shè)計(jì)和蛋白結(jié)晶方向取得豐碩的成果，特別是改造和設(shè)計(jì)自然界不存在的酶，如Kemp elimination 酶[22]、Diels-Alder Reaction酶[23]等；Dan S. Tawfik團(tuán)隊(duì)是以色列著名的酶學(xué)研究團(tuán)隊(duì)之一，該團(tuán)隊(duì)提出的根據(jù)蛋白質(zhì)序列進(jìn)化關(guān)系系統(tǒng)設(shè)計(jì)點(diǎn)突變的理論和方法，經(jīng)常能夠得到酶活與穩(wěn)定性成百倍提升的正向結(jié)果，并在此基礎(chǔ)上揭示了蛋白質(zhì)進(jìn)化的理論[27]；Jens Erik Nielsen團(tuán)隊(duì)在耐(嗜)酸堿性改造中發(fā)展出了一套成功的理論，他們所開(kāi)發(fā)的pKaTool和pKD軟件等，能隨意設(shè)計(jì)酶分子中任一位置氨基酸的pKa值，通過(guò)計(jì)算可預(yù)測(cè)出該酶的pH譜，這對(duì)有些需要進(jìn)行酸堿改造的酶工程提供了一種有效的理論和方法[28]。

5展望

酶的酶學(xué)屬性與工業(yè)屬性有時(shí)并不完全相同，而酶學(xué)的理論研究更是難以準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)酶工業(yè)屬性的改造，因此利用蛋白質(zhì)分子改造和設(shè)計(jì)方法來(lái)設(shè)計(jì)、改變或加強(qiáng)酶的某一工業(yè)屬性(如耐酸堿性、穩(wěn)定性和酶活性分子改造等)顯得尤為重要。了解國(guó)際上最前沿的蛋白質(zhì)分子改造和設(shè)計(jì)的相關(guān)理論，是我國(guó)蛋白質(zhì)(酶)學(xué)科快速發(fā)展的必要途徑。目前從大分子酶來(lái)設(shè)計(jì)小分子(如抑制劑)的理論與成功的例子較多，但是對(duì)于跨學(xué)科逆向設(shè)計(jì)和基于小分子設(shè)計(jì)新型大分子生物酶，由于其理論和技術(shù)都很復(fù)雜，國(guó)外也還是剛剛開(kāi)始起步，且大多集中在醫(yī)藥領(lǐng)域，我國(guó)在該領(lǐng)域方面起步也比較晚；因此更應(yīng)加大投入，爭(zhēng)取在該領(lǐng)域迎頭趕上。

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(編校：葉超)

Research Progress of Molecular Modification and Design of Novel Proteins (Enzymes) Based on Bioinformatics

SUN Weifeng, ZHONG Wenjuan, SUN Bin, WU Yuanming, GOU Yun, LIN Quanxiu, CHEN Xianggui, LIU Yi

(SchoolofFoodandBioengineering,FoodBiotechnologyLaboratoryofSichuanUniversities,XihuaUniversity,Chengdu610039China)

Abstract:The molecular modification and design of proteins (enzymes) are major challenges for human beings in the face of complex nature. They happened in accident incidents and adhered to inevitable law in the natural evolution of proteins, which is meaningful for the protein industry. In this paper, new strategies and the implementation process for the molecular modification and design of novel biological enzymes are introduced, as well as some advanced research teams and their achievements, in order to provide reference for proteins molecular modification and design.

Keywords:bioinformatics; proteins molecular modification; enzymes design

doi:10.3969/j.issn.1673-159X.2016.02.013

中圖分類號(hào)：Q816

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-159X(2016)02-0067-5

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(21506172)；四川省教育廳項(xiàng)目(15205445)；西華大學(xué)校重點(diǎn)項(xiàng)目(z1420524)；西華大學(xué)校重點(diǎn)項(xiàng)目(z1420525)；西華大學(xué)食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(szjj2015-013,szjj2015-014)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510623003,201510623053)。

收稿日期：2015-11-12

第一作者：張偉峰(1982—)，女，講師，博士，主要研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

·生物工程·