張麗娟 馬蕊 王月英 李德冠

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

免疫誘導(dǎo)IRM-2小鼠再生障礙性貧血模型的研究

張麗娟 馬蕊 王月英 李德冠

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 建立IRM-2小鼠再生障礙性貧血（AA）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并檢測(cè)其血液及相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)。方法 IRM-2小鼠經(jīng)137Cs γ射線6 Gy照射后，輸入DBA/2小鼠的胸腺細(xì)胞，建成免疫介導(dǎo)型AA模型。實(shí)驗(yàn)分3組，即對(duì)照組、照射組和AA模型組，于照射后第15天檢測(cè)小鼠的血常規(guī)和免疫學(xué)指標(biāo)。結(jié)果 IRM-2小鼠AA模型組外周血WBC、RBC、骨髓有核細(xì)胞數(shù)和網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比分別為（2.38±0.53）×109/L、（8.22±0.21）×1012/L、（7.14±1.19）×106/股骨和（50.2± 8.9）‰，均低于對(duì)照組 [（8.23±0.41）×109/L、（10.24±0.91）×1012/L、（16.5±1.61）×106/股骨和（76.2± 9.7）‰]；IRM-2小鼠AA模型組免疫學(xué)指標(biāo)中CD4+細(xì)胞比例[（8.91±2.55）%]低于對(duì)照組[（16.14± 3.09）%]，CD8+細(xì)胞比例[（13.55±2.12）%]高于對(duì)照組[（6.83±1.14）%]。IRM-2小鼠AA模型組外周血及免疫學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 IRM-2小鼠AA動(dòng)物模型的建立，對(duì)AA的研究具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

貧血，再生障礙性；模型，動(dòng)物；免疫誘導(dǎo)；評(píng)價(jià)研究

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81372928）;Natural Science Foundation of Tianjin（15JCZDJC35200）;Research Fund of Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences（1539）

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種骨髓造血功能衰竭癥，是以全血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)的一種綜合征[1]。近年來(lái)，對(duì)AA的機(jī)制研究已逐漸深入到分子生物學(xué)水平，動(dòng)物模型的建立是研究其機(jī)制的基礎(chǔ)。建立動(dòng)物模型的方法主要包括物理、化學(xué)和免疫介導(dǎo)等，很多學(xué)者進(jìn)行了多方面的探索和改進(jìn)。本研究運(yùn)用電離輻射及免疫介導(dǎo)在RM-2小鼠中建立AA小鼠模型，在此基礎(chǔ)上對(duì)AA小鼠模型的全血細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞（reticulocyte，Ret）、骨髓及免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，為AA的發(fā)病機(jī)理、藥物篩選及防治研究提供了較好的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

DBA/2近交系小鼠，雄性，5只，體重22～24g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2005-0013；IRM-2近交系小鼠由我所培育[2-3]，雄性，30只，體重22～24 g，合格證號(hào)：SCXK（津）2005-0001。

1.2 主要儀器與試劑

137Cs γ照射源（CAMMA-CELL40，加拿大原子能有限公司），照射劑量為6Gy，劑量率為0.84Gy/min；Coulter Ahra流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；pocH-100i血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自日本希森美康公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的兔抗鼠CD4抗體、藻紅蛋白標(biāo)記的兔抗鼠CD8抗體均購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司。

1.3 分組與照射方法

將IRM-2小鼠按體重分為3組，即對(duì)照組、照射組、AA模型組，每組10只，每組小鼠平均體重差異不能大于1，從而盡可能減少每組小鼠的生物差異性。其中，照射組和AA模型組小鼠接受6.0 Gy37Cs γ射線一次性全身照射。

1.4 AA模型小鼠的建立

處死DBA/2小鼠，取出胸腺，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行研磨，過(guò)濾，制成細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，經(jīng)眼靜脈叢注入照射后的IRM-2小鼠體內(nèi)，0.2 ml/只。對(duì)照組和照射組注入等量的RPMI-1640培養(yǎng)液。

1.5 外周血常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定

照射后15 d，通過(guò)小鼠眼球取血200 μl，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)量外周血WBC、RBC、血小板數(shù)和血紅蛋白（hemoglobin，HGB）含量。

1.6 Ret及骨髓有核細(xì)胞（bone marrow nucleated cells，BMNC）計(jì)數(shù)

同1.5中的方法取血100 μl，用1%煌焦油藍(lán)染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)Ret；取出小鼠單側(cè)股骨，沖出骨髓，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定BMNC。另取外周血，裂解紅細(xì)胞后分別加入相應(yīng)抗體進(jìn)行避光孵育，用流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD4、CD8、CD40、CD80/86、B220等指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA模型小鼠外周血指標(biāo)

AA模型小鼠外周血各指標(biāo)計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1，由表可見(jiàn)，AA模型小鼠的WBC、RBC、HGB含量和血小板數(shù)均比對(duì)照組和照射組低，其中，與對(duì)照組和照射組比較，WBC、RBC和血小板數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（WBC：t=27.603、7.835，P均＜0.05；RBC：t=6.841、6.016，P均＜0.05；血小板：t=13.944、6.737，P均＜0.05）；與對(duì)照組比較，HGB含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.063，P＜0.05）。

2.2 AA模型小鼠BMNC和Ret

AA模型小鼠BMNC數(shù)和Ret百分比結(jié)果見(jiàn)表2，由表可見(jiàn)，AA模型小鼠BMNC數(shù)和Ret百分比均比對(duì)照組和照射組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（BMNC：t=15.867、2.773，P均＜0.05；Ret：t= 6.245、3.084，P均＜0.05）。

表1 AA模型小鼠外周血各指標(biāo)計(jì)數(shù)（±s）Table 1 The counts of peripheral blood indexes in aplastic anemia model（±s）

表1 AA模型小鼠外周血各指標(biāo)計(jì)數(shù)（±s）Table 1 The counts of peripheral blood indexes in aplastic anemia model（±s）

注：表中，AA：再生障礙性貧血；HGB：血紅蛋白。

組別 只數(shù)對(duì)照組 10照射組 10 AA模型組 10 WBC（×109/L）血小板（×109/L）8.23±0.41 10.24±0.91 149.7±11.6 1216.4±78.1 4.82±0.83 9.83±0.82 132.1±12.1 996.2±132.1 2.38±0.53 8.22±0.21 121.2±13.5 635.1±106.2 RBC（×1012/L）HGB（g/L）

2.3 AA模型小鼠外周血免疫學(xué)分型

AA模型小鼠外周血免疫學(xué)分型結(jié)果見(jiàn)表3，由表可見(jiàn)，AA模型小鼠CD4+細(xì)胞比例低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.963，P＜0.05）；CD8+、CD40+、CD80+/86+細(xì)胞比例均高于對(duì)照組和照射組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CD8+：t=8.829、8.048，P均＜0.05；CD40+：t=10.767、11.072，P均＜0.05；CD80+/86+：t=6.988、9.241，P均＜0.05）；B220+細(xì)胞比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.172，P＜0.05）；CD4+/CD8+值低于對(duì)照組和照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.085、3.718，P均＜0.05）。

表2 AA模型小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)和網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比（±s）Table 2 The count of BMNC and percentage of Ret in aplastic anemia model（±s）

表2 AA模型小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)和網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比（±s）Table 2 The count of BMNC and percentage of Ret in aplastic anemia model（±s）

組別 只數(shù)對(duì)照組 10照射組 10 AA模型組 10 BMNC（×106/股骨） Ret（‰）16.5±1.61 76.2±9.7 9.28±2.13 59.8±4.2 7.14±1.19 50.2±8.9

3 討論

AA是一類以造血組織功能衰竭為特征的綜合征[1，4-5]，主要表現(xiàn)為骨髓造血功能低下及外周血全血細(xì)胞減少，AA具有治愈難、病勢(shì)延緩的特點(diǎn)，目前認(rèn)為該病的主要發(fā)病機(jī)制為造血干細(xì)胞減少或缺損、造血微環(huán)境損傷以及T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)。針對(duì)不同發(fā)病機(jī)制，建立AA動(dòng)物模型，對(duì)于深入研究AA發(fā)病機(jī)制和選擇有效的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。目前，先天性AA動(dòng)物模型，諸如Fanc A-/-、Fanc C-/-、Fanc G-/-、Fanc D1-/-/Fanc 2-/-、Fanc D2-/-等小鼠及其他基因缺陷小鼠的AA模型較多[6]，而用電離輻射及免疫介導(dǎo)方法建立AA模型小鼠較少，本研究用該方法成功建立了AA模型小鼠。目前對(duì)AA動(dòng)物模型評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)包括：全血細(xì)胞、Ret和骨髓象三系血細(xì)胞[1，4]，本研究對(duì)AA模型小鼠全血細(xì)胞、Ret、BMNC的檢測(cè)結(jié)果表明，AA模型組小鼠WBC、RBC、血小板數(shù)和HGB含量均低于對(duì)照組和照射組，BMNC數(shù)及Ret百分比顯著下降，與對(duì)照組和照射組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究建立的AA模型小鼠，其外周血常規(guī)、Ret百分比和BMNC數(shù)等指標(biāo)均符合AA動(dòng)物模型的要求，與臨床AA患者各項(xiàng)指標(biāo)相符或相近，證明了本研究建立的AA動(dòng)物模型是成功的。AA的發(fā)病機(jī)理除與造血干細(xì)胞本身缺陷、造血微環(huán)境損傷有關(guān)外，免疫功能異常也是一個(gè)重要的因素。CD4+細(xì)胞是具有輔助誘導(dǎo)性的T細(xì)胞亞群（Th），其增多表示B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白增多及細(xì)胞免疫力增強(qiáng)，CD8+是抑制性T細(xì)胞（Ts）中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）亞群，其增多表示免疫抑制；CD4+/CD8+值表示Th與Ts之間的功能平衡狀態(tài)，是人體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要指標(biāo)，該比值降低可引起機(jī)體免疫功能紊亂。AA患者的外周血CD4+細(xì)胞比例降低，CD8+細(xì)胞比例升高，CD4+/ CD8+值失調(diào)；本研究結(jié)果表明，AA模型小鼠CD4+細(xì)胞比例低于對(duì)照組，CD8+細(xì)胞比例高于對(duì)照組，CD4+/CD8+值失調(diào)，這與臨床上AA患者的情況基本相符[5-6]。T細(xì)胞活化相關(guān)的共刺激分子CD40+、CD80+/86+等也參與了AA的發(fā)病過(guò)程，CD40+屬于腫瘤壞死因子受體超家族，其表達(dá)異常是AA患者免疫功能紊亂的原因之一；CD80+/86+分子表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞上，并介導(dǎo)了對(duì)AA患者造血機(jī)能的破壞。本研究中AA模型小鼠CD40+、CD80+/86+細(xì)胞比例高于對(duì)照組和照射組，表明體液免疫和細(xì)胞免疫都可能增強(qiáng)并參與AA的發(fā)生，這與臨床對(duì)AA患者的研究結(jié)果相符[7-9]，從結(jié)果可以看出，本研究建立的AA模型小鼠的BMNC數(shù)、Ret百分比、外周血及分型等指標(biāo)的變化與人類AA患者各項(xiàng)指標(biāo)相符或相近，說(shuō)明本研究成功構(gòu)建了AA動(dòng)物模型，對(duì)AA的研究具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

表3 AA模型小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群比例（±s）Table 3 The percentage of lymphocyte subsets in peripheral blood in aplastic anemia model（±s）

表3 AA模型小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群比例（±s）Table 3 The percentage of lymphocyte subsets in peripheral blood in aplastic anemia model（±s）

注：表中，AA：再生障礙性貧血。

組別 只數(shù)對(duì)照組 10照射組 10 AA模型組 10 CD80+/86+（%）16.14±3.09 21.12±6.06 10.36±6.22 15.38±6.35 8.91±2.55 36.64±3.55 CD4+（%）CD8+（%） B220+（%） CD4+/CD8+值 CD40+（%）6.83±1.14 33.86±6.39 2.51±0.91 13.33±1.36 7.14±1.36 41.78±8.26 1.82±0.87 11.26±2.12 13.55±2.12 40.31±6.88 0.73±0.32 20.93±1.77

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開(kāi)展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明 張麗娟、馬蕊、王月英負(fù)責(zé)方法建立、現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、論文撰寫等工作；李德冠負(fù)責(zé)方法建立、論文審閱等工作。

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Immune-induced aplastic anemia IRM-2 mice model research

Zhang Lijuan,Ma Rui,Wang Yueying,Li Deguan
Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences,Tianjin 300192,China

Li Deguan,Email：lideguan@irm-cams.ac.cn

ObjectiveTo perform traditional blood and immunologic examinations for the pathogenesis of immune-induced aplastic anemia（AA）IRM-2 mice model.MethodsIRM-2 mice were divided into three groups,namely,the control,radiation,and AA model groups.IRM-2 inbred mice in the AA model group were used to set up the AA model by whole body137Cs γ irradiation and eye venous plexus injection with DBA/2 mice thymus cells.After 15 days of radiation,blood and bone marrow cells were counted,and immunologic detection was performed.ResultsThe peripheral WBC,RBC,bone marrow cells,and reticulocyte[（2.38±0.53）×109/L,（8.22±0.21）×1012/L,（7.14±1.19）×106/femur,and（50.2± 8.9）‰]in the AA model group were lower than those of the control group [（8.23±0.41）×109/L,（10.24± 0.91）×1012/L,（16.5±1.61）×106/femur,and（76.2±9.7）‰].CD4+cells[（8.91±2.55）%]of the AA model group were lower than those of the control group[（16.14±3.09）%],whereas CD8+cells[（13.55±2.12）%] were higher than those of the control group[（6.83±1.14）%].Peripheral blood and immunological indexes of the AA model group were statistically different from those of the control group.ConclusionIRM-2 mice AA model was successfully established as a good model for the study of AA.

Anemia,aplastic;Models,animal;Immune induction;Evaluation studies

李德冠，Email：lideguan@irm-cams.ac.cn

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.02.008

國(guó)家自然科學(xué)基金（81372928）；天津市重點(diǎn)基金（15JCZDJC35200）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所開(kāi)發(fā)基金（1539）

2016-01-06）