張　昊，崔岱宗，張　淼，趙　敏（東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱　150040）

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固定化技術(shù)在偶氮染料廢水處理中的應(yīng)用技術(shù)

張昊，崔岱宗，張淼，*趙敏
（東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040）

摘要：研究利用固定化包埋的方法，將1株偶氮染料降解菌固定于聚乙烯醇（PVA）顆粒內(nèi)部，并測(cè)定其在好氧條件下對(duì)染料的降解特性。研究表明，聚乙烯醇（PVA）在包埋過(guò)程中相對(duì)其他2種載體（明膠和海藻酸鈉）有球型好、硬度大、不易黏連、耐受高溫等優(yōu)點(diǎn)。染料降解試驗(yàn)表明，該固定化顆粒在反應(yīng)體系溫度為40℃，pH值為5～6的環(huán)境中有最佳降解速率。包埋后的細(xì)菌相對(duì)于游離細(xì)菌可以連續(xù)使用更多的次數(shù)，在保持球型完整的情況下可連續(xù)使用8次以上，在實(shí)際應(yīng)用中具有重要的意義。

關(guān)鍵詞：固定化；聚乙烯醇；偶氮染料；微生物降解

目前，染料廢水的排放量占工業(yè)廢水排放總量的10%，并且隨著現(xiàn)代染料與印染工業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大，染料廢水的排放量還在不斷升高。在全球范圍內(nèi)，每年都有15%的染料廢物被排放到環(huán)境中，對(duì)全球范圍內(nèi)的生態(tài)環(huán)境造成了極大的威脅[1]。染料廢水的顏色濃度高、化學(xué)組成復(fù)雜，且其所含的有機(jī)物大多是具有致癌、致畸、致突變能力的物質(zhì)[2-3]。若不經(jīng)過(guò)處理直接排放，會(huì)給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重威脅，對(duì)人類健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重影響。偶氮染料生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)工藝成熟、色光良好且不易褪色，因而廣泛應(yīng)用于紡織品及皮革制品的染色工藝中[4]。其化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，成分比較復(fù)雜，是公認(rèn)處理難度較高的有機(jī)廢水[5]。

利用微生物在繁殖過(guò)程中的生長(zhǎng)代謝來(lái)分解廢水中有機(jī)物的方法叫做生物法。微生物有體積小、表面積大、繁殖速度快的優(yōu)勢(shì)，且微生物細(xì)胞內(nèi)的降解酶具有專一性和高效性，對(duì)環(huán)境的抗逆性強(qiáng)[6]。因此，生物法是目前最為環(huán)保的染料降解方法，有著廣闊的應(yīng)用前景。

固定化技術(shù)主要包括載體結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法，其中包埋法是固定化技術(shù)中較為理想的方法[7]。利用高分子聚合物在聚合的過(guò)程中會(huì)形成類似于孔隙的間隔，將相對(duì)較小的微生物細(xì)胞包埋在孔隙中，從而達(dá)到細(xì)胞固定的目的。該方法操作簡(jiǎn)單，可以將微生物固定在聚合物所形成的特殊空間當(dāng)中，且這種結(jié)構(gòu)較為緊密，可以防止細(xì)胞在空間中流動(dòng)滲漏[8]。然而，分子質(zhì)量相對(duì)較小的染料底物和細(xì)胞產(chǎn)物則可以在孔隙中自由流動(dòng)，對(duì)細(xì)胞毒害作用較小，固定化強(qiáng)度較高、穩(wěn)定性較好。

本試驗(yàn)利用1株偶氮染料降解菌H10，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和微生物固定化技術(shù)將其包埋，再通過(guò)染料降解試驗(yàn)探索和優(yōu)化細(xì)菌固定化的條件，以及固定化顆粒對(duì)偶氮染料的降解效果和其在降解體系中的連續(xù)使用能力，為實(shí)際應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所使用的菌株H10分離于遼寧海城某印染廠附近長(zhǎng)期受偶氮染料污染的土壤中。經(jīng)研究表明，H10菌株可在有氧條件下，對(duì)偶氮類染料進(jìn)行高效降解。海藻酸鈉、甲基紅、聚乙烯醇（PVA）、明膠、碳酸氫鈉、胰蛋白胨、硼酸、戊二醛、氯化鈣、液體石蠟、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、酵母提取物等均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司。

1.2驗(yàn)方法

1.2.1 PVA固定化顆粒的制備

將1.5%海藻酸鈉與10%的PVA混合，微波爐加熱使其完全溶解，冷卻后加入OD600為1.2的菌懸液混合均勻，用20 mL注射器將其滴入飽和硼酸溶液中交聯(lián)2 h，再轉(zhuǎn)移至1 mol/L的Na2PO4溶液中繼續(xù)交聯(lián)2 h，得到白色有彈性的固定化顆粒，然后用生理鹽水清洗2次后可長(zhǎng)時(shí)間保存在冰箱中備用。

1.2.2海藻酸鈉固定化顆粒的制備

取2%的海藻酸鈉加熱溶解，冷卻后加入OD600為1.2的菌懸液，用玻璃棒攪動(dòng)液體使細(xì)菌充分散開(kāi)，用20 mL注射器將溶液逐滴加入2% CaCl2溶液中進(jìn)行交聯(lián)，8 h后過(guò)濾取出，用生理鹽水洗凈備用。

1.2.3明膠固定化顆粒的制備

將12%的明膠溶液加熱溶解，冷卻至室溫后加入OD600為1.2的菌懸液混合均勻，將液體石蠟置于冰浴中，再將明膠溶液用注射器滴入液體石蠟中形成小球，待小球成型后過(guò)濾將其置于0.5%戊二醛中交聯(lián)2 h。

1.2.4不同固定化載體對(duì)偶氮染料降解效率的對(duì)比

取100 mL三角瓶，裝入50 mL的LB培養(yǎng)基后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻后向瓶中加入2.5 mL配制好的甲基紅染液，使體系中的染料質(zhì)量濃度為100 mg/L；再取海藻酸鈉、PVA、明膠固定化顆粒分別加入降解體系中。將以上降解體系置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)，每2 h測(cè)定吸光度，繪制降解曲線。

1.2.5固定化顆粒的連續(xù)使用能力測(cè)定

向50 mL的LB培養(yǎng)基中加入2.5 mL甲基紅染液使體系中染料質(zhì)量濃度為100 mg/L，再加入制作好的PVA固定化小球。另做對(duì)照組，向LB培養(yǎng)基中加入2.5 mL染料，并加入OD600為1.2的等量游離菌液。將降解體系置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，測(cè)定染料完全降解后的吸光度和所需的降解時(shí)間。待降解反應(yīng)進(jìn)行完全后，測(cè)定游離菌試驗(yàn)組中的吸光度，并將OD600值調(diào)至1.2，再加入等體積的染料進(jìn)行第2次反應(yīng)；試驗(yàn)組中則直接過(guò)濾出固定化顆粒加入新的降解體系中進(jìn)行反應(yīng)。連續(xù)該步驟直至降解反應(yīng)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行，比較固定化顆粒和游離菌的連續(xù)使用能力。

1.2.6固定化顆粒在pH值梯度條件下的降解能力對(duì)比

配制NaOH和HCl母液，備用。將LB培養(yǎng)基高壓滅菌，加入等量染料溶液使反應(yīng)體系染料終質(zhì)量濃度為100 mg/L，同時(shí)加入等量固定化顆粒。用pH計(jì)調(diào)整反應(yīng)體系酸堿度，使其分別為2，12。將以上反應(yīng)體系置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)，每6 h測(cè)定吸光度，檢驗(yàn)染料降解效果。

1.2.7固定化顆粒在不同溫度條件下的降解能力對(duì)比

將LB培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌處理，加入等量的固定化顆粒以及終質(zhì)量濃度為100 mg/L的甲基紅染料。分別將以上降解體系置于恒溫培養(yǎng)箱中，并設(shè)定降解溫度別為10，20，30，40，50℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，測(cè)定各體系中的降解率。

2　結(jié)果與分析

2.1同固定化載體對(duì)偶氮染料降解效率的對(duì)比結(jié)果

由于不同固定化載體之間的材質(zhì)不同，所形成的固定化孔隙不同，對(duì)細(xì)菌的包埋能力和強(qiáng)度不同，且染料溶液在其內(nèi)部的擴(kuò)散性能不同，因而造成了使用不同包埋劑制成的固定化顆粒對(duì)染料降解速率的不同。

不同固定化載體對(duì)偶氮染料降解效率的對(duì)比見(jiàn)圖1。

圖1　不同固定化載體對(duì)偶氮染料降解效率的對(duì)比

由圖1可見(jiàn)，以游離細(xì)菌作為對(duì)照，各試驗(yàn)組的降解率差別很大。其中，游離細(xì)菌試驗(yàn)組僅經(jīng)過(guò)6 h染料降解率就可達(dá)到88%以上，降解體系中無(wú)肉眼可見(jiàn)的紅色。其他試驗(yàn)組中以PVA組的降解效果最為顯著，幾乎達(dá)到了與對(duì)照組相同的速度，說(shuō)明PVA對(duì)細(xì)菌能起到很好的包埋效果，對(duì)微生物的毒害作用小，且對(duì)介質(zhì)的通透性良好。海藻酸鈉組的降解效果次于PVA組，8 h后的降解率也達(dá)到87%以上。作為一種天然提取物包埋劑，其固定化效果很好，球型完整均勻且無(wú)黏連現(xiàn)象，適于用作固定化的載體，可在固定方法上加以優(yōu)化，以提高其降解速率。明膠組的染料降解試驗(yàn)結(jié)果不理想，8 h后降解率仍未達(dá)到50%，且其固定化方法較為復(fù)雜，需要使用戊二醛等化學(xué)試劑，對(duì)人體有害。盡管其球型較好，但硬度不夠、黏連現(xiàn)象較為嚴(yán)重。某些細(xì)菌可以以明膠為食，固定化顆粒后期可能出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，總體來(lái)看不適宜用作細(xì)菌固定化材料。綜上，本研究后續(xù)進(jìn)展均采用PVA作為固定化載體。

2.2定化顆粒的連續(xù)使用降解能力測(cè)定結(jié)果

固定化包埋細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)在于其方便回收和可重復(fù)利用的性質(zhì)，因此連續(xù)投加試驗(yàn)的結(jié)果可以反應(yīng)其在實(shí)際應(yīng)用中的性能以及相對(duì)游離細(xì)菌的巨大優(yōu)勢(shì)。

游離H10菌的連續(xù)使用能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　游離H10菌的連續(xù)使用能力測(cè)定結(jié)果

由表1可見(jiàn)，游離細(xì)菌僅在第1次的試驗(yàn)中將甲基紅降解了83%以上，為了保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在每次連續(xù)投加染料之前都重新調(diào)整菌液的OD值，以保證加入的細(xì)菌數(shù)量一致。而在第2次試驗(yàn)中，游離細(xì)菌已經(jīng)發(fā)生了部分退化，6 h后肉眼可見(jiàn)仍有甲基紅未被降解，16 h后測(cè)定的降解率為78%。第3次降解試驗(yàn)在20 h后降解率為83%，此時(shí)容器中的菌液顏色已由初始的乳白色變暗，表示細(xì)菌發(fā)生了比較嚴(yán)重的退化。第4次連續(xù)降解試驗(yàn)將降解時(shí)間延長(zhǎng)至24 h，降解率僅為46%。

PVA固定化顆粒連續(xù)使用降解能力測(cè)定見(jiàn)圖2。

圖2　PVA固定化顆粒連續(xù)使用降解能力測(cè)定

由圖2可見(jiàn)，以PVA作為固定化載體的試驗(yàn)組在連續(xù)使用8次以后仍具有較強(qiáng)的降解能力，在降解時(shí)間為6 h的條件下降解率始終在80%～90%，且連續(xù)使用8次之后固定化顆粒無(wú)明顯變化，球型完整無(wú)破裂。值得注意的是，降解率在前5次連續(xù)降低之后，出現(xiàn)輕微回升，考慮是否因?yàn)榧?xì)菌在固定化顆粒內(nèi)部可以進(jìn)行增殖，使顆粒內(nèi)部細(xì)菌數(shù)量上升導(dǎo)致降解速率的加快。這個(gè)觀點(diǎn)有待于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

結(jié)果證明，本研究所制成的固定化小球極為耐用。郭建博等人曾研究指出，利用海藻酸鈣方法制成的小球在連續(xù)使用4次后，其加速降解反應(yīng)的能力開(kāi)始減小，并且隨著連續(xù)使用次數(shù)的繼續(xù)增加，海藻酸鈣小球的強(qiáng)度也會(huì)開(kāi)始降低。而本試驗(yàn)中使用PVA方法制成的固定化顆粒在連續(xù)使用了8次之后依然具有很強(qiáng)的降解能力，且在此過(guò)程中PVA小球的球型一直保持完整，顯示出了PVA作為固定化載體相對(duì)于游離細(xì)菌在連續(xù)使用能力上的巨大優(yōu)勢(shì)，適于在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中應(yīng)用。

2.3定化顆粒在pH值梯度條件下的降解能力對(duì)比結(jié)果

為了檢驗(yàn)固定化顆粒在極端pH值條件下的降解能力，本研究測(cè)定了pH值梯度對(duì)固定化顆粒的影響。

固定化顆粒在pH值梯度條件下的降解能力對(duì)比見(jiàn)圖3。

圖3　固定化顆粒在pH值梯度條件下的降解能力對(duì)比

由圖3可見(jiàn)，PVA固定化顆粒在pH值為5～9均具有良好的降解效果，都能達(dá)到最終66%以上的降解率。其中，在降解體系的pH值為6時(shí)的固定化顆粒對(duì)染料降解速率最快，6 h的降解率為84.53%；而pH值小于5和pH值大于9的部分均未能對(duì)染料進(jìn)行有效降解，因此未在圖3中顯示其結(jié)果。然而，在pH值2～11時(shí)，反應(yīng)體系中的PVA固定化顆粒均未發(fā)生溶解、破裂等現(xiàn)象，因此可知PVA材料有較強(qiáng)的耐酸堿性，適合用于各種pH值條件。圖3中降解速率產(chǎn)生差別原因在于，極端pH值條件下細(xì)菌產(chǎn)生的酶活性受到影響，進(jìn)而影響了染料降解。

2.4定化顆粒在不同降解溫度條件下的降解能力對(duì)比結(jié)果

降解溫度梯度試驗(yàn)檢驗(yàn)了PVA固定化顆粒在不同降解溫度中對(duì)染料的降解能力，對(duì)實(shí)際應(yīng)用具有重要的意義。

固定化顆粒在不同降解溫度下對(duì)偶氮染料的降解率見(jiàn)圖4。

圖4　固定化顆粒在不同降解溫度下對(duì)偶氮染料的降解率

由圖4可見(jiàn)，包埋菌的最適降解溫度為40℃左右，該條件下6 h的降解率可以達(dá)到69.26%；其余降解溫度試驗(yàn)組的降解率均在28.91%以下。而當(dāng)降解時(shí)間延長(zhǎng)至24 h之后，40℃以下試驗(yàn)組的降解率均有了很大的提高，只有50℃環(huán)境試驗(yàn)組沒(méi)有繼續(xù)降解。推測(cè)細(xì)菌所產(chǎn)生的偶氮染料還原酶在高溫條件下發(fā)生失活，而在6 h以內(nèi)，固定化顆粒內(nèi)部處于溫度上升期，細(xì)菌所產(chǎn)生的酶未達(dá)到失活溫度之前進(jìn)行了一部分降解；當(dāng)降解溫度達(dá)到50℃以后，酶失活導(dǎo)致染料不再發(fā)生降解。

另外，在50℃的試驗(yàn)組中，可以觀察到PVA固定化顆粒的體積有了明顯增大，小球外表不再呈現(xiàn)乳白色，產(chǎn)生了透明效果；其他降解溫度試驗(yàn)組中PVA顆粒沒(méi)有明顯的體積變化。據(jù)此推測(cè)，高溫可能會(huì)對(duì)固定化載體的材料產(chǎn)生一定影響，不同材料可以耐受的最高溫度不同，在實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)不同的降解溫度環(huán)境選擇不同種類的載體材料。

3　結(jié)論

本研究利用載體包埋的方法對(duì)偶氮染料降解菌株H10進(jìn)行固定化處理，并對(duì)固定化后得到的顆粒進(jìn)行了一系列試驗(yàn)測(cè)定其降解能力，試驗(yàn)結(jié)論如下。

在載體選擇上使用PVA作為包埋劑得到的固定化顆粒球型好，孔隙大小適宜，可以在固定住細(xì)菌的同時(shí)使染料分子、酶類及其他生物代謝產(chǎn)物自由通過(guò)，可多次連續(xù)使用且對(duì)微生物無(wú)毒害作用。PVA固定化顆?？梢阅褪躳H值2～11的極端酸堿環(huán)境，且當(dāng)反應(yīng)體系pH值在5～9時(shí)，固定化顆粒中的細(xì)菌可對(duì)染料進(jìn)行降解，其中最佳pH值為6；過(guò)高或過(guò)低的降解溫度均會(huì)對(duì)細(xì)菌活性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響染料降解速率，因此試驗(yàn)測(cè)定固定化顆粒在37℃附近有著最佳的降解效果，PVA固定化顆粒在50℃以下的環(huán)境中均保持穩(wěn)定，在50℃時(shí)體積開(kāi)始發(fā)生膨脹、顏色變透明、孔隙變大，據(jù)此推測(cè)PVA作為包埋劑的固定化顆粒不適于在高溫下作業(yè)。在pH值、降解溫度條件均為最優(yōu)的情況下，PVA固定化顆?？梢栽诒３智蛐屯暾那闆r下連續(xù)使用8次以上，在實(shí)際應(yīng)用中具有重要的意義。

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The Application of Immobilization Method in Degradation of Azo Dye Wastedwater

ZHANG Hao，CUI Daizong，ZHANG Miao，*ZHAO Min
（Department of Microbiology，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040，China）

Abstract：In this study，a strain of azo dyes degradation bacteria is immobilized in the PVA granular.The degradation characteristics are investigated by measuring the decolorization rate of azo dyes in aerobic conditions.The results indicate that PVA granular has better performance in shape，stability and dispersity compared with gelatin and sodium alginate granular.The decolorization results indicate that PVA granular can make the best effect of decolorization at 40℃and pH 5～6.Meanwhile，the granular can support more decolorization cycles compare with dissociative bacteria，it can maitain intact spherical continuous use for more than 8 times，which has a significant values in practical industries.

Key words：immobilization；PVA；azo dyes；microbial degradation

中圖分類號(hào)：TQ613.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.02.038

文章編號(hào)：1671-9646（2016）02b-0034-04

收稿日期：2015-12-11

作者簡(jiǎn)介：張昊（1990—），男，碩士，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。

*通訊作者：趙敏（1964—），男，博士，教授，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。