趙　珊，張　晶，丁曉靜，楊蘊嘉，邵　兵

(北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室，北京　100013)

超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法檢測豆制品中12種禁用工業(yè)染料

趙珊，張晶，丁曉靜，楊蘊嘉，邵兵*

(北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室，北京100013)

摘要：建立了超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時檢測豆制品中12種橙黃色工業(yè)染料(堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹黃、蘇丹橙G、二乙基黃、堿性嫩黃O、溶劑黃124、酸性橙Ⅱ、酸性間胺黃、酸性黃11和茜素黃R)的分析方法。樣品經(jīng)酸化乙腈提取;提取液于-20 ℃冷凍2 h后離心，可有效去除豆制品中的脂質(zhì)類干擾物;梯度洗脫條件下經(jīng)ACQUITY UPLC?BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)分離后采用多離子反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測，4種工業(yè)染料(酸性橙Ⅱ、酸性間胺黃、酸性黃11和茜素黃R)使用負離子模式，以乙腈-0.1%氨水為流動相，其余8種采用正離子模式檢測，流動相為乙腈-0.1%甲酸水。結(jié)果表明：豆制品中12種工業(yè)染料的定量下限(LOQ)為0.2～10.0 μg/kg，3個加標水平的回收率為76.2%～122.0%，相對標準偏差為1.1%～7.4%，各項指標滿足食品中痕量污染物檢測的需要。該方法操作簡便、靈敏度高，實現(xiàn)了12種禁用橙黃色染料的同時提取和凈化，適合于豆制品中非法添加工業(yè)染料的篩查、確證。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;工業(yè)染料;豆制品

食品中非食用色素的違禁添加問題引起了廣泛關(guān)注，2011年4月我國衛(wèi)生部發(fā)布了《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》，在名單中涉及豆制品中可能違法添加的非食用色素有豆腐皮中添加堿性橙2(又名王金黃)，豆制品中添加堿性嫩黃，豆瓣醬中添加酸性橙Ⅱ。為此，質(zhì)監(jiān)部門組織開展了豆制品及重點食品的專項檢查，重點查處使用堿性橙2及其他非食用原料的違法行為。然而，豆制品中非法添加非食用色素的現(xiàn)象并未消失，2014年12月臺灣媒體再度報道了豆制品中被查出添加工業(yè)染料二甲基黃(又名奶油黃、蘇丹黃)、二乙基黃，這兩種染料均為親脂性偶氮化合物，被國際癌癥研究署(IARC)列為2B等級的致癌物，禁止用作食品添加劑。為加強國內(nèi)豆制品中違法添加的監(jiān)管力度，擴充檢測目標物，建立境內(nèi)境外有可能添加的非食用色素同時篩查的方法是十分必要的。

食品中非法添加堿性橙2、堿性嫩黃O、酸性橙Ⅱ和酸性間胺黃等工業(yè)染料的檢測方法已有報道，常見于液相色譜法[1-6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[6-11];蘇丹橙G、蘇丹黃作為蘇丹系列染料與蘇丹紅同時檢測多采用LC-MS/MS法[ 7-8,12-14]，近期豆制品中添加二甲基黃(蘇丹黃)、二乙基黃的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也已見文獻報道[15-16]，然而對于豆制品中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃O、酸性橙Ⅱ、酸性間胺黃、蘇丹橙G、蘇丹黃和二乙基黃9種橙黃色目標物的同時檢測方法，尚未見文獻報道。本研究亦將脂溶性染料溶劑黃124和水溶性染料酸性黃11、茜素黃R作為豆制品中橙黃色染料檢測的目標物，建立了豆制品中極性差異很大的12種橙黃色染料的同時提取、凈化和LC-MS/MS檢測方法。

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

ACQUITYTM超高效液相色譜儀、 Xevo TQ-S 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);11BS25型粉碎機(德國IKA公司)。堿性橙2(C12H12N4·HCl，純度98.2%)、堿性橙21(C22H23ClN2，99.5%)、堿性橙22(C28H27ClN2，100.0%)購于振翔公司;蘇丹黃(二甲基黃)(C14H15N3，99.5%)、蘇丹橙G(C12H10N2O2，98.6%)、二乙基黃(C16H19N3，99.0%)、酸性橙Ⅱ(C16H11N2NaO4S，94.0%)、溶劑黃124(C22H31N3O2，99.0%)、酸性黃11(C16H13N4NaO4S，100.0%)、酸性間胺黃(C18H14N3NaO3S，99.0%)購于Dr.Ehrenstorfer GmbH;堿性嫩黃O(C17H21N3·HCl，98.0%)、茜素黃R(C13H9N3O5，96%)購于Acros Organics公司。標準儲備液均用乙腈溶解配制，按純度標示折算制成100 mg/L。乙腈、甲醇(色譜純，Dikma 科技有限公司);甲酸(98%，Acros Organics公司);氯化鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2樣品預(yù)處理

稱取1 g(精確至0.01 g)粉碎的豆制品樣品于50 mL塑料離心管內(nèi)，加入2.5 mL水、50 μL冰乙酸、10 mL乙腈，渦旋混勻15 s，超聲萃取30 min，靜置分層，4 ℃下以10 000 r/min離心10 min后，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL刻度管內(nèi)，殘渣再加入50 μL冰乙酸、10 mL乙腈提取1次，合并上清液。提取液中加入約0.5 g氯化鈉，于-20 ℃冷凍2 h，取出后于4 ℃下 10 000 r/min離心5 min，乙腈層用于LC-MS/MS測定。

稱取1 g空白基質(zhì)樣品，每份樣品按上述萃取過程進行處理，得到的基質(zhì)提取液用于配制基質(zhì)匹配工作曲線及高濃度樣品溶液稀釋。

1.3色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1正離子測定色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm);柱溫：40 ℃;流動相：A為乙腈;B為0.1%甲酸水溶液。流速：0.3 mL/min;進樣量：5 μL。梯度洗脫程序：0～10.0 min，15%A線性升至100%A;保持2 min，然后迅速降至15%A。

ESI(+)離子源：毛細管電壓：2.8 kV;離子源溫度：100 ℃;脫溶劑氣溫度：350 ℃;脫溶劑氣流量：800 L/h。

1.3.2負離子測定色譜柱同上;柱溫：40 ℃;流動相：A為乙腈;B為0.1%氨水。流速：0.3 mL/min;進樣量：5 μL。梯度洗脫程序：0～1.5 min，10% A;1.5～5.0 min線性升至100%A;保持2 min，然后迅速降至10%A。

ESI(-)離子源：毛細管電壓：2.5 kV;離子源溫度：100 ℃;脫溶劑氣溫度：350 ℃;脫溶劑氣流量：800 L/h 。各種染料的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1　12種染料的質(zhì)譜采集條件

2結(jié)果與討論

2.1液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

溶劑黃124、酸性黃11和茜素黃R 3種染料的檢測未見文獻報道，分別對其單標標準溶液進行一級離子掃描，確定溶劑黃124的電離方式為正離子模式，酸性黃11和茜素黃R為負離子模式。其中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹黃、蘇丹橙G、二乙基黃、堿性嫩黃O、溶劑黃124在ESI(+)檢測模式下，酸性橙Ⅱ、酸性間胺黃、酸性黃11和茜素黃R在ESI(-)檢測模式下均可獲得兩個豐度比較高的子離子，分別作為定性和定量離子，建立的多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

ESI(+)檢測模式下的8種化合物極性差異較大，以0.1%甲酸水和乙腈為流動相，優(yōu)化梯度洗脫條件，8種染料組分在ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱上獲得了良好分離。豆制品中8種染料的加標色譜圖見圖1。ESI(-)檢測模式下的4種化合物極性均較強，首先采用水-乙腈為流動相進行優(yōu)化，茜素黃R的色譜峰形拖尾，進而采用10 mmol/L乙酸銨-乙腈、10 mmol/L碳酸銨-乙腈、0.1%氨水-乙腈優(yōu)化分離條件，當(dāng)流動相中加入少量乙酸銨或碳酸銨時均可使茜素黃R的色譜峰形得到改善，抑制拖尾;然而流動相中加入少量乙酸銨會使得酸性橙Ⅱ的響應(yīng)降低，碳酸銨的加入使得酸性黃11的峰形展寬;而采用0.1%氨水-乙腈為流動相時，各組分的色譜峰形良好，負離子化效率明顯增強，檢測靈敏度提高。圖2為豆制品基質(zhì)中負離子模式下4種染料的加標色譜圖。

2.2樣品前處理方法的選擇

2.2.1提取溶劑的選擇12種目標化合物中酸性橙Ⅱ等4種負離子模式化合物和堿性橙2的極性強、水溶性好，而溶劑黃124、蘇丹黃和二乙基黃的極性較弱、脂溶性好，因此提取溶劑的選擇需考慮對各組分的溶解能力，乙腈為首選溶劑[8,14];對于脫水的豆制品樣品如腐竹、豆皮等，若直接用乙腈提取，不易滲透到樣品組織，因此需加入水，使其溶脹。本研究選擇水-乙腈、水-乙酸-乙腈及水-硫酸銨-乙腈3種溶劑進行了提取率的考察，以基質(zhì)匹配外標法計算，結(jié)果見圖3。其中，水-硫酸銨-乙腈的提取效率相對較低，水-乙腈和水-乙酸-乙腈均具有較高的提取率，考慮到豆制品中含有30%～40%的蛋白質(zhì)，酸性溶液有利于蛋白沉淀，因此選擇水-乙酸-乙腈作為提取溶劑?？疾炝颂崛〈螖?shù)對回收率的影響，實驗表明第2次提取各目標化合物的提取率在5.2%～17.8%之間。由此可見，兩次提取才可獲得較高的回收率。

2.2.2凈化豆制品中含有的脂質(zhì)類成分被萃取到提取液中，可能會對質(zhì)譜響應(yīng)產(chǎn)生抑制，降低靈敏度，并影響色譜柱的使用壽命。固相萃取是食品基質(zhì)中目標化合物常用的凈化手段，金玉娥等[3]采用WAX固相萃取小柱凈化豆干和黃魚中的酸性橙Ⅱ和酸性間胺黃，然而由于本研究中12種化合物的結(jié)構(gòu)差異非常大，考慮到成本因素，很難采用固相萃取凈化，因此采用鹽析和冷凍的方式去除脂肪等干擾物質(zhì)：即在提取液(乙腈及少量水)中加入氯化鈉置于-20 ℃冷凍2 h，取出后離心，提取溶液分層，上層乙腈澄清透明，由此可見，冷凍后蛋白、脂肪沉淀析出，達到了凈化提取液的目的。由圖1～2可見，12種目標化合物經(jīng)色譜分離,MRM模式進行檢測后，色譜峰無雜質(zhì)干擾。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1標準曲線與定量下限取豆制品空白樣品，加入混合標準系列，按“1.2”樣品預(yù)處理方法進行提取、凈化，以選定的定量離子峰面積(Y)對含量(X，μg/kg)繪制標準曲線，12種染料的線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。正離子模式下，堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹黃、蘇丹橙G、二乙基黃、堿性嫩黃O、溶劑黃124 的線性范圍為1.0～25.0 μg/L；負離子模式下，另外4種待測物的線性范圍為2.5～62.5 μg/L。從樣品加標提取液獲得每種化合物的信噪比接近于10(S/N=10)的濃度，確定為該化合物的定量下限(LOQ)。由表2可見，12種染料的LOQ為0.2～10.0 μg/kg，表明樣品經(jīng)提取凈化后，減少了基質(zhì)抑制，可獲得較高的靈敏度。

表2　豆制品中12種染料的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量下限

2.3.2回收率與相對標準偏差分別取豆制品空白基質(zhì)，添加3個濃度水平的混合標準溶液，按“1.2”方法進行處理，UPLC-MS/MS測定提取液中目標化合物的濃度。每個濃度點取6份樣品進行平行實驗，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表3。 12種染料的回收率為76.2%～122.0%，RSD為1.1%～7.4% 。說明該方法可獲得較理想的提取效果。

表3　豆制品中12種染料的回收率和相對標準偏差(n=6)

2.4方法應(yīng)用

應(yīng)用本方法對市售25份樣品(腐竹、豆皮、豆干)進行測定，未檢出陽性樣品。

3結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測豆制品中12種橙黃色工業(yè)染料的方法，樣品經(jīng)酸化乙腈提取、-20 ℃冷凍凈化后可有效除去蛋白和脂質(zhì)類干擾物，使得12種目標化合物達到同時提取凈化。通過優(yōu)化質(zhì)譜條件，8種工業(yè)染料(堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹黃、蘇丹橙G、二乙基黃、堿性嫩黃O、溶劑黃124 )采用正離子模式，乙腈-0.1%甲酸水為流動相;另4種工業(yè)染料(酸性橙Ⅱ、酸性間胺黃、酸性黃11和茜素黃R)采用負離子模式，以乙腈-0.1%氨水為流動相，均可獲得較高的靈敏度和較好的峰形。UPLC-MS/MS檢測方法的定量下限、回收率和精密度均滿足痕量分析的要求，適用于豆制品中12種工業(yè)染料的同時篩查與確證。

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Determination of 12 Banned Dyes in Soy Products by Ultra Performance Liquid Chromatography with Electospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Shan，ZHANG Jing，DING Xiao-jing,YANG Yun-jia，SHAO Bing*

(Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning，Beijing Center for Disease Prevention and Control，Beijing100013，China)

Abstract：An analytical method was developed for the simultaneous determination of 12 banned dyes(basic orange 2，basic orange 21，basic orange 22，dimethyl yellow，ethyl yellow，sudan orange G，auramine O，solvent yellow 124，orangeⅡsodium salt，metanil yellow，acid yellow 11 and allzarin yellow R) in soy products by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).Soy products samples were extracted using acetonitrile acidified with acetic acid.After frozen for 2 h under-20 ℃，the extracts were centrifuged to reduce lipids and other related interference.The target compounds were separated on an ACQUITY UPLC?BEH C18column by means of a binary mobile phase gradient with water containing 0.1% ammonium hydroxide formic acid and acetonitrile for 4 dyes(orangeⅡsodium salt，metanil yellow,acid yellow 11 and allzarin yellow R) and 0.1% formic acid and acetonitrile for the other eight compounds.Mass spectrometric acquisition was carried out by means of multiple reaction monitoing(MRM) under negative ionization mode for 4 dyes and positive mode for the rest of target compounds，respectively.As a result，quantitation limits of 12 dyes in soy products samples were in the range of 0.2-10.0 μg/kg.Mean recoveries at three spiked levels ranged from 76.2% to 122.0%，and the relative standard deviations(RSDs)were between 1.1% and 7.4%，which complied with the regulations for the determination of trace contaminants residues in food matrix.Simultaneous extraction and purification of 12 dyes in soy products matrix was achieved upon the established method which could be applied in the routine detection of illegally additive dyes in soy products due to its simplicity and high sensitivity.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);dyes;soy products

收稿日期：2015-09-06;修回日期：2015-09-29

基金項目：質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研項目(2012104003-3)

*通訊作者：邵兵，博士，研究員，研究方向：食品安全分析，Tel：010-64407191，E-mail：shaobingch@sina.com

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.010

中圖分類號：O657.63;F767.4

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0432-06