薄威 王旭光 張忠 韓瑩

[摘要] 目的 探討從石蠟包埋胃鏡組織中提取幽門螺桿菌菌體DNA的方法和策略。 方法 選取2008年5月～2010年5月中國醫(yī)科大學(xué)263例胃癌術(shù)后石蠟包埋標本及2011年6月～2014年6月醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院和沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院206例幽門螺桿菌陽性石蠟包埋標本，利用試劑盒提取菌體DNA、PCR擴增，對擴增的結(jié)果進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果 263例胃癌大體標本中， 231例檢測出隨意選取基因片段，陽性率為87.83% ；206例胃鏡標本中，194例檢測出幽門螺桿菌cagA基因，陽性率為89.81%。胃大體標本和胃鏡標本DNA提取陽性率之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 從石蠟包埋胃鏡組織中提取幽門螺桿菌菌體DNA是高效可行的。

[關(guān)鍵詞] 石蠟包埋組織；幽門螺桿菌；DNA；基因擴增

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2016）08-0121-03

從胃癌術(shù)后石蠟包埋組織中提取人體基因組DNA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種回顧性研究，隨著研究的深入和方法的改進，人們從石蠟包埋的少量胃鏡組織也可獲得較理想的DNA[1-3]，但國內(nèi)尚未見從石蠟包埋胃鏡組織提取幽門螺桿菌菌體DNA的報道，主要是由于胃鏡組織塊本身很小，并且H.pylori主要定殖部分胃小凹和腺體內(nèi)，數(shù)量少之又少，限制了對H.pylori DNA特點的深入研究。目前為分析H.pylori的DNA，人們多采用胃鏡獲取新鮮胃黏膜，隨即在培養(yǎng)基上進行涂抹，于體外進行細菌培養(yǎng)，從而獲得菌體DNA，這樣改變H.pylori生存的微環(huán)境，無形中增加了人為因素。因此，我們在從胃癌術(shù)后石蠟包埋組織中提取人體基因組DNA的研究基礎(chǔ)上，進行多方面嘗試從石蠟包埋的胃鏡組織中提取H.pylori DNA。

1 材料與方法

1.1 材料來源

263例胃癌術(shù)后石蠟包埋標本來自于中國醫(yī)科大學(xué)（2008～2010年），206例胃鏡石蠟包埋標本來自于沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院和沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（2011～2014年）室溫保存至今。

1.2 H.pylori的HE染色及特染

206例胃鏡標本按常規(guī)方法每例標本制作切片3張，厚度為5 μm，分別進行常規(guī)HE染色、H.pylori特殊染色——吉姆薩染色（吉姆薩染色液G1010 北京索萊寶科技有限公司）和亞甲藍（MST-8027 胃幽門螺桿菌染色試劑盒邁新試劑）染色。具體方法見試劑盒。

1.3 DNA提取方法

石蠟組織提取DNA采用的是北京基因公司的試劑盒（GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT NO. 56404），胃癌術(shù)后標本，每例標本連續(xù)切10～12片，每片厚5 μm，胃鏡標本每例連續(xù)切18～20片，切片厚度為4 μm，放入1.5 mL離心管中，然后按試劑盒操作提取DNA。

1.4 PCR反應(yīng)

胃癌術(shù)后標本隨機選取一對基因進行PCR擴增，上游引物5 CAA GCA GTC ATC CTT CTC TC 3； 下游引物5GCA CTT AGG GAT CCC AT GAA 3； 擴增條件94℃ 7min，94℃ 30s，54℃ 20s，72℃ 30s，72℃ 10min，40個循環(huán)，4℃保存。

胃鏡標本對H.pylori的cagA基因進行巢式PCR擴增。引物序列為cagA 1F 5 CGT TGA TAA CGA TAG GGA TAA C 3；cagA1R 5 GAT CCC CAA ATT TCT GAA AGC TCT T 3；cagA 2F 5 CGA TAG GGA TAA CAG GCA AGC TT 3；cagA1R 5 CTG AAA GCT CTT TGT GGA AGA TTC3兩次PCR反應(yīng)體系均為20 μL，其中含模板DNA 2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物1.25 μL、taq酶0.2 μL，去離子水補足到20 μL。第二次PCR中DNA模版為第一次PCR產(chǎn)物，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min，72℃ 5 min， 兩次PCR各進行30個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料組間比較進行χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H.pylori判定

分別進行HE染色、亞甲藍染色、吉姆薩染色，三者之一陽性，即為陽性，見封三圖10、11、12。

2.2 胃鏡標本和大體標本菌體

DNA提取的比較（χ2=0.449，P=0.45>0.05），所以大體和胃鏡標本DNA提取陽性率之間無顯著性差異。見表1。

2.3 菌體DNA的檢測

擴增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，F(xiàn)lourChem FC2紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果（封三圖13）。胃鏡206例標本中有194例檢測出cagA條帶，檢出率為89.81%。大體263例標本中有231例檢測出隨意選取基因條帶，檢出率為87.83% 。

3 討論

每年約有900萬的胃癌新發(fā)病例，其中75%是與幽門螺桿菌（H.pylori）的感染密切相關(guān)的[4]。相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍.pylori致病性特別是菌體 DNA的特性進行了廣泛而深入的研究[5-7]。在對菌體DNA研究時，多采用活檢胃黏膜體外菌培養(yǎng)的方法，雖然菌培養(yǎng)可以獲得高濃度和純度的菌體DNA，但菌培養(yǎng)是人為制造的體外環(huán)境，所以并不能完全反映H.pylori在人體內(nèi)微環(huán)境的變化。那么有沒有更好的方法能替代菌培養(yǎng)呢？人們試想從甲醛固定-石蠟包埋（FFPE）組織中提取菌體DNA，臨床上對于石蠟包埋組織的制備多在取得新鮮組織1周內(nèi)完成，這不但可以較好地表達H.pylori在人體內(nèi)微環(huán)境中的生長和繁殖情況，并且可以解決在短時間內(nèi)收集到大量新鮮標本的難題。但由于石蠟包埋胃鏡組織中菌體量極少，國內(nèi)尚無人嘗試。我們借鑒了大量在FFPE組織中提取人體基因組DNA的經(jīng)驗[8-10]，并且采用巢式PCR的方法成功地提取到菌體DNA。結(jié)果顯示應(yīng)用FFPE從組織中提取菌體cagA的DNA陽性率為89.81%，這與國內(nèi)宮月華[11]在體外培養(yǎng)中選取菌株cagA基因檢測的陽性率94.4%（101/107）的結(jié)果是相似的。在我們前期的實驗研究中，對263例福爾馬林固定的大材標本進行DNA提取，其中有231例提取得到DNA，陽性率87.83%，低于此次的石蠟包埋標本提取DNA的陽性率，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。充分說明從FFPE組織中提取菌體DNA的方法是可行的，可替代體外菌培養(yǎng)。

從FFPE組織中提取菌體DNA有助于追蹤長時間的腫瘤分子標志的改變，利于回顧性研究[12]。但我們對菌體DNA提取的陽性率并不是100%的，盡管在提取菌體DNA之前我們對H.pylori進行了特染，選擇了H.pylori陽性的標本?？紤]的主要原因為經(jīng)過石蠟包埋容易造成DNA不可逆降解、堿基與組蛋白交聯(lián)以及苯、寡聚核苷酸片段等一些PCR抑制劑的存在，這使PCR擴增成為難題[13-15]。在應(yīng)用傳統(tǒng)PCR方法無法從FFPE組織中擴增出清晰的電泳條帶時，我們選擇兩對嵌套的引物，即應(yīng)用巢式PCR后，獲得了清晰條帶，增加了可重復(fù)性，提高了特異性。另外，我們還發(fā)現(xiàn)其他一些策略可提高DNA產(chǎn)量：①在熔蠟的次數(shù)選擇兩次效果最好，次數(shù)過少蠟不能被完全溶解掉，次數(shù)過多易造成DNA的損失，而且第一次根據(jù)包埋組織石蠟的熔點的溫度不同，選擇65℃水浴融蠟2 h比較徹底。②在傾倒離心后的上清液時力度一定要溫和，因為組織很輕，力度大易造成菌體DNA的流失。③切片的厚度在4～6 μm較適宜，過厚不利于蛋白酶消化，影響DNA產(chǎn)量，過薄易造成人為DNA損傷。我們認為由于切片的大小不同，以切片的重量計算更加準確，每次抽提25～35 mg切片較適宜，既能充分消化又能提高DNA的產(chǎn)量。盡管我們在石蠟包埋組織中提取菌體DNA取得了一些成效，但是也存在著問題。如果選擇H.pylori通用引物可能陽性率會更高些。另外，如何控制菌體過少時的離心時間和轉(zhuǎn)速，避免菌體微滴流失，也尚需解決，下一步我們將擴大樣本例數(shù)進一步改進方法，總結(jié)經(jīng)驗，以提高菌體DNA的陽性率。

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（收稿日期：2015-12-21）