趙增成 林樹乾 李桂明 黃中利 傅劍 馮敏燕 宋敏訓(xùn)

摘要：為了建立銀翹口服液的質(zhì)量標準，采用薄層色譜法（TLC）對處方中的金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、荊芥進行了定性鑒別，并采用高效液相色譜法（HPLC）對牛蒡苷含量進行測定。結(jié)果顯示，TLC色譜斑點清晰、專屬性強、陰性對照無干擾；在0.0622～0.6220 mg/mL范圍內(nèi)，牛蒡苷濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為102.4%，RSD為2.2%，樣品中牛蒡苷的平均含量為6.7246 mg/mL。本研究所建立的檢測方法簡便、準確、專屬性強、重復(fù)性好，可對銀翹口服液的質(zhì)量進行有效控制。

關(guān)鍵詞：銀翹口服液；薄層色譜；高效液相色譜；質(zhì)量標準

中圖分類號：S859.79文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0124-06

銀翹口服液是本課題組研發(fā)的新獸藥，處方源于《溫病條辨》之“銀翹散”，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、桔梗、淡竹葉、甘草等組成，功效為辛涼解表、清熱解毒，主治外感風(fēng)熱或溫病初起[1～4]。為了制定銀翹口服液的質(zhì)量標準，本研究采用薄層色譜法對制劑中金銀花、連翹、薄荷、荊芥、牛蒡子進行了鑒別研究，以組方中牛蒡子的主要有效成分牛蒡苷為指標成分，采用高效液相色譜法對其含量進行了測定。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

金銀花對照藥材（批號121060-201107）、綠原酸對照品（批號110753-201114）、連翹對照藥材（批號120908-201016）、連翹苷對照品（批號110821-201110）、薄荷對照藥材（批號120916-201109）、薄荷腦對照品（批號110728-201006）、荊芥對照藥材（批號120911-201110）、牛蒡子對照藥材（批號120903-201109）、牛蒡苷對照品（批號110819-201108），均購置于中國食品藥品檢定研究院。銀翹口服液，由山東昊泰科技藥業(yè)有限公司試制。乙睛為色譜純試劑，甲醇、甲酸、異丙醇、三氯甲烷、磷酸等均為分析純試劑。

1.2試驗儀器

安捷倫高效液相色譜儀，AB265-S型雙量程電子天平，KQ5200DB型超聲儀，硅膠G板（青島海洋化工廠），聚酰胺薄膜（青島海洋化工廠）。

1.3試驗方法

1.3.1薄層鑒別①金銀花的薄層鑒別。取綠原酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液作為對照品溶液。再取金銀花對照藥材0.2 g，加甲醇5 mL，放置12 h，過濾，取濾液作為對照藥材溶液。另取銀翹口服液10 mL，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，3 500 r/min離心30 min，取上清液水浴蒸干，用甲醇2 mL溶解，放置后取上清液作為供試品溶液。取不含金銀花的銀翹口服液同法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗[5]，吸取以上溶液各2 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以異丙醇-甲醇-甲酸（9∶1∶0.5）的溶液為展開劑，展開，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。

②連翹的薄層鑒別。取連翹苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，作為對照品溶液。另取連翹對照藥材1 g，加石油醚（30～60℃）20 mL，超聲處理15 min，過濾，棄去石油醚液，殘渣揮干石油醚，加甲醇20 mL，密塞，超聲處理20 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL溶解，作為對照藥材溶液。取銀翹口服液30 mL，加甲醇60 mL，超聲處理30 min，3 500 r/min離心30 min后取上清液蒸干，用2 mL甲醇溶解，放置后取上清液作為供試品溶液。同法將不含連翹的銀翹口服液制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取連翹苷對照品溶液15 μL，連翹對照藥材溶液20 μL，供試品溶液和陰性對照品溶液各30 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶1.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。

③牛蒡子的薄層鑒別。取牛蒡苷對照品，加甲醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作為對照品溶液。另取牛蒡子對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL溶解，作為對照藥材溶液。取銀翹口服液10 mL，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，3 500 r/min離心30 min后取上清液蒸干，用2 mL甲醇溶解，放置后取上清液作為供試品溶液。取不含牛蒡子的銀翹口服液同法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取對照品溶液、對照藥材溶液各5 μL，吸取供試品溶液、陰性對照液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（40∶8∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。

④荊芥的薄層鑒別。取荊芥對照藥材0.8 g，加石油醚（60～90℃）20 mL，密塞，時時振搖，放置過夜，過濾，濾液揮至1 mL，作為對照藥材溶液。取銀翹口服液10 mL，加石油醚（60～90℃）20 mL，超聲處理30 min，置分液漏斗中，靜置后取石油醚層，水浴蒸干，放冷后，用2 mL石油醚（60～90℃）溶解，作為供試品溶液。取不含荊芥的銀翹口服液同法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑展開，取出晾干，噴以5%香草醛的5%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

⑤薄荷的薄層鑒別。取薄荷腦對照品，加石油醚（60～90℃）制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。另取薄荷對照藥材0.5 g，加石油醚（60～90℃） 5 mL，密塞，振搖數(shù)分鐘，放置30 min，過濾，濾液揮至1 mL，作為對照藥材溶液。再取銀翹口服液10 mL，加20 mL石油醚（60～90℃），超聲處理30 min，置分液漏斗中靜置數(shù)分鐘后取石油醚層，水浴蒸干，用2 mL石油醚（60～90℃）溶解，作為供試品溶液。用去除薄荷的銀翹口服液同法制取陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取以上各種溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（19∶1）為展開劑展開，取出晾干，噴以香草醛硫酸試液-乙醇（1∶4）的混合溶液，100℃加熱至斑點顯色清晰。

1.3.2高效液相色譜法測定牛蒡苷含量 ①色譜條件。在對影響指標成分牛蒡苷分離度和響應(yīng)值的主要因素（包括色譜柱、柱溫等）進行考察和優(yōu)化的基礎(chǔ)上，最終確定色譜條件為：Agilent XDB-C18色譜柱，柱溫25℃，流速1 mL/min，進樣量5 μL，乙腈-0.4%磷酸溶液（25∶75）為流動相，檢測波長為277 nm。

②對照品、供試品溶液及陰性對照品溶液的制備。牛蒡苷對照品溶液的制備：精密稱取牛蒡苷對照品，加甲醇制成濃度為0.3110 mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密量取銀翹口服液5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇15 mL，超聲30 min，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

陰性對照品溶液的制備：按處方制備工藝制成去除牛蒡子的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

③系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。分別吸取牛蒡苷對照品、供試品溶液及陰性對照品溶液各5 μL，按以上所建立的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

④標準曲線制備。取牛蒡苷對照品用50%甲醇分別配制成0.0622、0.1244、0.1866、0.3110、0.4354、0.6220 mg/mL 6個濃度，按建立的色譜條件依次進樣，記錄色譜圖與峰面積，以峰面積對牛蒡苷的濃度進行線性回歸。

⑤精密度試驗。將對照品溶液進樣5 μL，重復(fù)進樣測定6次，記錄色譜圖與峰面積，考察儀器的測定結(jié)果重現(xiàn)性。

⑥重復(fù)性試驗。將同一批號的樣品，按供試品溶液制備方法，平行制備成6份供試品溶液，按建立的色譜條件分別進行測定，記錄色譜圖與峰面積。

⑦穩(wěn)定性試驗。吸取供試品溶液，按建立的色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h進行試驗測定，記錄色譜圖與峰面積。

⑧加樣回收率試驗。平行精密量取配制好的供試品溶液1 mL（牛蒡苷含量0.6725 mg/mL），共6份，分別置50 mL量瓶中，分別加入0.3110 mg/mL對照品溶液2 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按照建立的色譜條件進行試驗，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積計算，測定牛蒡苷含量，計算回收率。

回收率（%）=（測得牛蒡苷的量-制劑中牛蒡苷原有量）/加入牛蒡苷對照品的量×100

⑨樣品牛蒡苷含量測定。選取10批樣品，按照建立的色譜條件進行試驗，記錄色譜圖和峰面積，計算出樣品中牛蒡苷的含量。

2結(jié)果與分析

2.1薄層鑒別結(jié)果

2.1.1金銀花的薄層鑒別由圖1可知，供試品色譜中，在與對照品綠原酸色譜和金銀花對照藥材色譜相應(yīng)的位置上有顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照液色譜中無相應(yīng)熒光斑點。

2.1.2連翹的薄層鑒別由圖2可知，供試品色譜中，在與對照品連翹苷色譜和連翹對照藥材色譜相應(yīng)的位置上有顯相同顏色的斑點，陰性對照液色譜中無相應(yīng)斑點。

2.1.3牛蒡子的薄層鑒別由圖3可知，供試品色譜中，在與對照品牛蒡苷色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上有顯相同顏色的斑點，陰性對照液色譜中無相應(yīng)斑點。

2.1.4荊芥的薄層鑒別由圖4可知，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上有顯相同顏色的斑點，陰性對照液色譜中無相應(yīng)斑點。

2.1.5薄荷的薄層鑒別由圖5可知，供試品色譜中，在與薄荷腦對照品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上有顯相同顏色的斑點，陰性對照液色譜中無相應(yīng)的斑點。

2.2牛蒡苷含量測定結(jié)果

2.2.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗圖6顯示，銀翹口服液樣品色譜圖中，在與牛蒡苷對照品色譜圖的相應(yīng)位置上有相同保留時間的色譜峰，在此保留時間，陰性對照液無色譜峰出現(xiàn)。樣品色譜中牛蒡苷峰與相鄰峰分離良好，陰性對照溶液中所含成分對牛蒡苷測定無干擾作用。

2.2.2牛蒡苷線性關(guān)系考察不同濃度的對照品溶液峰面積結(jié)果見表1。

以牛蒡苷濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制牛蒡苷標準曲線，見圖7。將表1中的數(shù)據(jù)進行線性回歸，得到線性回歸方程：y=2684.3x-0.3691（R2=1.0000）。結(jié)果表明，牛蒡苷進樣量在0.0622～0.6220 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3精密度試驗結(jié)果見表2，RSD為0.27%，表明本方法精密度良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4，RSD為1.85%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6加樣回收率試驗結(jié)果見表5，平均回收率為102.4%，RSD為2.2%，表明該方法準確可信。

2.2.7樣品牛蒡苷含量測定10批樣品的含量測定結(jié)果見表6，牛蒡苷平均含量為6.7246 mg/mL。

3討論

3.1薄層色譜法（TLC）是一種快速、靈敏、高效地分離和定性分析微量物質(zhì)的方法，因其設(shè)備簡單、操作方便、專屬性好、分析速度快等特點，已成為中藥質(zhì)量控制的主要手段之一[6，7]。本研究對新研發(fā)的銀翹口服液中每味中藥的有效成分進行薄層定性鑒別，目的是檢出其藥味成分。經(jīng)過反復(fù)測定，發(fā)現(xiàn)口服液中金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、荊芥有效成分在薄層鑒別中色譜明顯、重復(fù)性好、專屬性強、無干擾，說明該方法可快速確定銀翹口服液中以上五味中藥的存在，因此可將其用于銀翹口服液質(zhì)量標準草案鑒別項。

3.2影響薄層鑒別的因素較多，主要包括樣品處理、薄層板、點樣量、展開劑、顯色劑等，可直接影響到色譜圖中斑點分離度、清晰度和重現(xiàn)性[8]。如點樣量太小，斑點不清晰；點樣量太多，展開劑不能全部負載，容易產(chǎn)生脫尾現(xiàn)象。供試液中雜質(zhì)成分較多，由于相互干擾或背景污染難以得到滿意的分離效果。對于難以分離的相鄰物質(zhì)，根據(jù)它們的理化性質(zhì)，選用極性大小適宜的溶劑并做好配比則最為關(guān)鍵[9，10]。本試驗分別對樣品處理、薄層板、點樣量、展開劑、顯色劑等影響薄層色譜的因素進行了反復(fù)篩選和優(yōu)化，最終確定了最佳的薄層色譜條件。

3.3處方中牛蒡子疏散風(fēng)熱、解毒利咽，其主要活性成分牛蒡苷是重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒等作用，其分子式、結(jié)構(gòu)式明確，因此將牛蒡苷確定為本品含量測定的指標成分。本研究所建立的高效液相色譜含量測定方法精確性、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可快速準確地測定出牛蒡苷的含量。上述鑒別和含量測定方法可用于銀翹口服液質(zhì)量標準和制劑質(zhì)量的有效檢測和控制。

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