瓜實(shí)蠅DNA甲基化的MSAP體系建立與優(yōu)化

龔治 周世豪 馬華博 張亞楠 符悅冠

摘 要 瓜實(shí)蠅[Bactrocera cucurbitae （Coquillett）]是中國(guó)重要的蔬菜害蟲，但其DNA甲基化研究尚未見(jiàn)報(bào)道。甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性是研究DNA甲基化的重要技術(shù)之一。通過(guò)對(duì)酶切反應(yīng)、連接、PCR擴(kuò)增和引物篩選等條件優(yōu)化，建立瓜實(shí)蠅MSAP反應(yīng)體系，即：①20 μL酶切體系中加入10 U的限制性內(nèi)切酶與600 ng基因組DNA，于37℃酶切反應(yīng)過(guò)夜；②20 μL連接體系中加入T4 連接酶1 U，HpaⅡ-MspⅠ-adapter接頭50 pmol，EcoR I-adapter接頭5 pmol，并于16℃反應(yīng)12 h；③連接產(chǎn)物稀釋后進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，再經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)該體系篩選出適用于瓜實(shí)蠅基因組DNA甲基化多態(tài)性研究的6對(duì)引物；瓜實(shí)蠅MSAP體系為瓜實(shí)蠅的表觀遺傳學(xué)研究提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 瓜實(shí)蠅 ；DNA甲基化 ；甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性 ；表觀遺傳

中圖分類號(hào) S186 ；Q963 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.008

Abstract The melon fly [Bactrocera cucurbitae （Coquillett）] is one of the most important vegetables insect pest in China. However， the DNA methylation in melon fly has not been reported yet. Methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP） is an important research tecnnique to analysis the DNA methylation. The MSAP can be established through the enzyme digestion reaction， ligation， PCR amplification system， and primer screening， such as 10 U restriction endonuclease is put in the 20 μL enzyme digestion system， and then react with 600 ng of genome DNA at 37℃ overnight； 1U of T4 ligase is put in the 20 μL ligation system， 50 pmol of HpaⅡ-MspⅠ-adapter and 5 pmol of EcoR I-adapter which react at 16℃ for 12 hours. Diluent ligation products were used in PCR to pre-amplification and selected amplification， the result is tested by silver staining and 6% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Six pairs of primers which suited for DNA methylation sensitive amplified polymorphism were selected out by this system. The MSAP system provides the technical support for the study of the epigenetics research of melon fly.

Keywords Bactrocera cucurbitae （Coquillett） ； DNA methylation ； Methylation sensitive amplified polymorphism， MSAP ； epigenetics

瓜實(shí)蠅[Bactrocera cucurbitae （Coquillett）]屬雙翅目（Diptera）實(shí)蠅科（Tephritidae），是世界性檢疫害蟲[1-2]，主要為害葫蘆科（Cucurbitaceae）和茄科（Solanaceae）植物，如甜瓜（Cucumis melo L.）、南瓜（Cucurbita moschata Duchesne.）、辣椒（Capsicum annuum L.）、苦瓜（Momordica charantia Linn.）、西瓜（Citrullus lanatus Thunb.）、無(wú)花果（Ficus carica Linn.）、番石榴（Psidium guajava Linn.）等[3-4]。瓜實(shí)蠅廣泛分布于亞熱帶30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[2]，在中國(guó)主要分布于南方，包括江蘇、福建、四川、湖南、臺(tái)灣等地[5]，是中國(guó)南方發(fā)生實(shí)蠅中的優(yōu)勢(shì)種，每年給中國(guó)南方果蔬生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[6]。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)瓜實(shí)蠅的分布、寄主、危害程度、生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理生化及綜合防治等進(jìn)行了大量研究[5，7]。然而瓜實(shí)蠅DNA甲基化及其基因表達(dá)調(diào)控等研究鮮有報(bào)道。甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（Methylation sensitive amplified polymorphism， MSAP）是研究DNA甲基化的重要方法之一，不僅能夠檢測(cè)基因組DNA甲基化位點(diǎn)的水平和模式，操作相對(duì)便捷，分析結(jié)果能夠直接與基因序列聯(lián)系起來(lái)，而且具有敏感性強(qiáng)、檢出位點(diǎn)多等特點(diǎn)，成為檢測(cè)基因組DNA甲基化的重要方法[8-9]。在中國(guó)，MSAP技術(shù)已應(yīng)用于橡膠樹(shù)新品種選育[10]、果蠅基因組甲基化[11]、白背飛虱性別和翅型分化[12]等方面的研究。MSAP及其DNA甲基化已逐漸成為昆蟲研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[13]。本研究以瓜實(shí)蠅為材料，建立和優(yōu)化MSAP分析技術(shù)體系，為不同條件下瓜實(shí)蠅基因組DNA甲基化多態(tài)性位點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)蠅

實(shí)驗(yàn)中所使用的瓜實(shí)蠅為羽化后2～3 d的飼養(yǎng)多代的室內(nèi)種群。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.TM Insect DNA kit購(gòu)自O(shè)mega Bio-tek公司；EcoRⅠ，MspⅠ，HpaⅡ，T4 DNA Ligase均為NEB產(chǎn)品；剝離硅烷、親和硅烷購(gòu)自北京鼎國(guó)生物工程公司；PCR相關(guān)試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；硝酸銀購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED為BBI公司進(jìn)口分裝藥品；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

按照Insect DNA Kit試劑盒推薦的方法提取基因組DNA。提取的DNA經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并經(jīng)紫外分光光度測(cè)定A260與A280值，并以此計(jì)算DNA的純度和濃度。DNA于-20℃保存待用。

1.2.2 酶切

選用HapⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ 2組內(nèi)切酶分別對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切。20 μL體系中，先加入15 μL ddH2O，再加入2 μL 10×NEB Buffer，濃度為300 ng/μL的模板DNA 2 μL，最后加入EcoRⅠ，HapⅡ或MspⅠ，酶的用量分別設(shè)置為：2、4、6、8、10 U?；靹蚝蠓湃氲蜏匮h(huán)水浴儀中，于37 ℃下進(jìn)行雙酶切1.0 h。之后選用最佳酶用量，分別進(jìn)行2.0、4.0、6.0、12.0 h等不同酶切時(shí)間，完成后用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)酶切產(chǎn)物。

1.2.3 連接

取等量接頭引物對(duì)混合，并于95℃加熱5 min，然后緩慢冷卻至室溫，在室溫下放置10 min制成接頭待用。連接體系為20 μL，將接頭等直接加入酶切液中，16℃連接12 h。接頭在加入酶切液之前先合為雙鏈（95℃ 5 min）。反應(yīng)體系中加入雙酶切液8.0 μL，10 ×T4 Buffer 2 μL，T4 連接酶各1.0 μL，接頭引物Eco RⅠ-adapter、MspⅠ-adapter的反應(yīng)終濃度分別設(shè)定為25、50、75 pmol/μL，混勻后放入低溫循環(huán)水浴儀中進(jìn)行連接。研究中所用到的接頭、引物見(jiàn)表1。

1.2.4 預(yù)擴(kuò)增

對(duì)連接產(chǎn)物分別進(jìn)行10倍、20倍、30倍稀釋，然后取2.5 μL用于預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。整個(gè)PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中2×Eco Taq PCR SuperMix 12.5 μL，預(yù)擴(kuò)增引物各1 μL（濃度為10 μmol/L）。預(yù)擴(kuò)增引物間進(jìn)行正交配對(duì)。PCR程序?yàn)椋?5℃變性3 min 后，按以下參數(shù)擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，最后72℃延伸10 min，10℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。剩余產(chǎn)物保存至-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 選擇性擴(kuò)增

對(duì)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行10倍、20倍、30倍稀釋，然后取5 μL用于選擇性擴(kuò)增反應(yīng)。整個(gè)PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中2×Eco Taq PCR SuperMix 12.5 μL，選擇性擴(kuò)增引物各3 μL（濃度為10 μmol/L）。選擇性擴(kuò)增引物間進(jìn)行正交配對(duì)。PCR程序?yàn)椋?5℃變性3 min 后；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，10℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。剩余產(chǎn)物保存至-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 引物篩選

采用優(yōu)化后的AFLP體系對(duì)16對(duì)選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行篩選。擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL 與3 μL loading buffer 混勻，95 ℃變性5 min，轉(zhuǎn)至冰浴中冷卻，取3 μL上樣，6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，銀染參照文獻(xiàn)等[14]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 提取結(jié)果

瓜實(shí)蠅基因組DNA電泳圖見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，提取的基因組DNA主帶清晰無(wú)降解，無(wú)RNA污染。而由表2可知，所提取的瓜實(shí)蠅基因組DNA的OD值均在1.7～1.9，說(shuō)明DNA純度較高，能夠滿足MSAP試驗(yàn)要求。

2.2 酶切反應(yīng)體系

用不同量的HapⅡ/Eco RⅠ和MspⅠ/Eco RⅠ 2組內(nèi)切酶分別對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，并于37℃下酶切1 h后，其產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。由圖2不同酶量的產(chǎn)物電泳圖可看出，10 U組的酶切效果最好，而其它各組仍然依稀可見(jiàn)基因組DNA。而酶切時(shí)間的篩選結(jié)果（圖3）可以看出，不同酶切時(shí)間均能對(duì)基因組DNA進(jìn)行一定程度的消化，但12 h 處理中，4、4泳道內(nèi)呈彌散狀且?guī)握R，表明酶切完全，其酶切效果優(yōu)于其它3組處理。故確定合適的酶切反應(yīng)條件為10 U用量的酶，于37℃反應(yīng)12 h。

2.3 預(yù)擴(kuò)增

圖4是不同引物對(duì)和不同稀釋倍數(shù)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。由圖4可以看出，根據(jù)電泳條帶的強(qiáng)弱、范圍及雜帶的多少進(jìn)行直觀分析。不同處理之間，由于連接產(chǎn)物稀釋濃度、預(yù)擴(kuò)增引物的不同，擴(kuò)增結(jié)果存在顯著差異。引物組合Eco RA-HpaⅡ-MspⅠC、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠT、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠC、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠG、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠC、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠG、Eco RC-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RC-HpaⅡ-MspⅠT、Eco RC-HpaⅡ-MspⅠC以及Eco RC-HpaⅡ-MspⅠG的擴(kuò)增效果差，均出現(xiàn)了較為明顯的條帶，說(shuō)明這些引物的擴(kuò)增效果不理想，不利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)篩選。對(duì)引物組合Eco RA-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RA-HpaⅡ-MspⅠT、Eco RA-HpaⅡ-MspⅠG、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠT進(jìn)行比較，引物對(duì)Eco RA-HpaⅡ-MspⅠG的擴(kuò)增效果最好，主帶主要集中在200～300 bp，且連接產(chǎn)物稀釋30倍的擴(kuò)增效果優(yōu)于稀釋10倍和20倍。因此選擇引物對(duì)Eco RA-HpaⅡ-MspⅠG組且連接產(chǎn)物稀釋30倍為最佳組合。

2.4 選擇性擴(kuò)增與銀染結(jié)果

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的初步篩選，采用Eco R-AN和HpaⅡ-MspⅠ-GN選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增（圖5、6）。由圖5可以看出，16個(gè)組合均擴(kuò)增出條帶。將16對(duì)不同引物組合的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳的銀染第2次篩選（圖6），所有引物均能擴(kuò)增出條帶。結(jié)合2次篩選結(jié)果，選取條帶清晰，多態(tài)性好的引物組合共6對(duì)，分別是：Eco R-AG和HpaⅡ-MspⅠ-GA，Eco R-AG和HpaⅡ-MspⅠ-GG，Eco R-AC和HpaⅡ-MspⅠ-GC，Eco R-AC和HpaⅡ-MspⅠ-GA，Eco R-AC和HpaⅡ-MspI-GT，Eco R-AC和HpaⅡ-MspⅠ-GG。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)MSAP反應(yīng)的酶切、連接、PCR擴(kuò)增和引物篩選等條件的優(yōu)化，建立了瓜實(shí)蠅DNA甲基化多態(tài)性檢測(cè)的技術(shù)體系，為后續(xù)瓜實(shí)蠅的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制研究提供了技術(shù)支撐。MSAP因其使用的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ對(duì)相同序列CCGG中甲基化修飾的敏感程度不同，導(dǎo)致HpaⅡ/Eco RⅠ和MspⅠ/Eco RⅠ 2種酶切結(jié)果經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生條帶的多態(tài)性，CCGG的甲基化修飾水平可以通過(guò)PAGE電泳譜帶的差異進(jìn)行分析。因此，酶切反應(yīng)的質(zhì)量是關(guān)系著MSAP分析成果的關(guān)鍵步驟。酶切不完全會(huì)造成甲基化分析的不完全，而酶切過(guò)度會(huì)產(chǎn)生非特異性片段，導(dǎo)致陽(yáng)性甲基化片段。這些都會(huì)在一定程度上影響MSAP分析效果。此外，在MSAP分析過(guò)程中的2個(gè)PCR反應(yīng)，模板濃度以及緩沖液的量是決定擴(kuò)增反應(yīng)是否成功的關(guān)鍵所在，模板稀釋濃度太大或太小都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稀釋濃度過(guò)大會(huì)發(fā)生拖尾現(xiàn)象，稀釋濃度過(guò)小條帶無(wú)法正常顯現(xiàn)分析。而緩沖液的量決定著PCR反應(yīng)中擴(kuò)增酶能否正常的發(fā)揮，緩沖液過(guò)大或過(guò)小都會(huì)影響酶活性。

HpaⅡ可以識(shí)別并切割非甲基化和單鏈甲基化（mCCGG/GGCCh或mCmCGG/GGCC）；而MspⅠ能識(shí)別并切割非甲基化和內(nèi)側(cè)甲基化位點(diǎn)（CmCGG/GGCC或CmCGG/GGmCC）而不能切割外側(cè)甲基化位點(diǎn)[15]。因此，MSAP技術(shù)在一定程度上也有局限性。陸光遠(yuǎn)[16]在對(duì)油菜的研究中提到MSAP技術(shù)檢出的DNA胞嘧啶甲基化是基于“CCGG/GGCC”序列，而“CCGG/GGCC”位點(diǎn)之外的胞嘧啶序列是否進(jìn)行了修飾不在該方法檢測(cè)之內(nèi)，但因?yàn)?0%左右的胞嘧啶甲基化修飾發(fā)生在“CpG”二核苷酸或“CpNpG”三核苷酸區(qū)域內(nèi)，因此，基于“CCGG/GGCC”序列研究基因組DNA或基因胞嘧啶甲基化修飾的MSAP是能夠在一定程度上反應(yīng)物種基因組甲基化修飾水平的[17]。另外，MSAP技術(shù)是基于AFLP技術(shù)發(fā)展而來(lái)，故還具有以下多方面的優(yōu)勢(shì)[18]：（1）可以用于研究非模式生物，甚至包括那些缺少基因組測(cè)序的物種。（2）該技術(shù)具有較好的成本效益，較容易按比例增加，而且相同的試劑能夠用于不同的物種研究。（3）可以在多個(gè)位點(diǎn)對(duì)大量個(gè)體進(jìn)行批量篩選，從而產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)來(lái)檢測(cè)種群和處理中發(fā)生的突變與分化。（4）該技術(shù)對(duì)環(huán)境誘導(dǎo)的DNA甲基化變異的檢測(cè)靈敏度高。因此，盡管MSAP在結(jié)果推理上具有一定的局限性，但該技術(shù)非常具有潛力。

瓜實(shí)蠅是中國(guó)南方瓜菜生產(chǎn)上的重要害蟲，已廣泛分布于中國(guó)多個(gè)省份，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)環(huán)境影響。雖然已對(duì)瓜實(shí)蠅的生態(tài)學(xué)、生物學(xué)以及生理生化等特性進(jìn)行了報(bào)道，然而瓜實(shí)蠅的危害、環(huán)境適應(yīng)及基因表達(dá)調(diào)控等分子機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。MSAP能夠有效地檢測(cè)到物種種群內(nèi)或種群間的DNA甲基化差異與表觀遺傳變異，從而為解析瓜實(shí)蠅如何適應(yīng)外界環(huán)境因子的影響提供新的途徑。而MSAP又能產(chǎn)生差異性的DNA片段，通過(guò)測(cè)序可能獲得響應(yīng)基因的重要信息，從而使得基因與表型聯(lián)系在一起，為深入探討瓜實(shí)蠅基因表達(dá)調(diào)控與表型提供了重要的研究方向。由此可見(jiàn)，DNA甲基化在生物個(gè)體應(yīng)對(duì)環(huán)境變化中發(fā)揮著重要作用。建立瓜實(shí)蠅DNA甲基化的分析技術(shù)具有重要意義。本研究建立并優(yōu)化瓜實(shí)蠅MSAP分析技術(shù)，為不同條件下瓜實(shí)蠅基因組DNA甲基化多態(tài)性位點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)。

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