楊和平，張貴強(qiáng)，謝榮漢，喬振虎，崔香香，韋英海

（1. 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530000；2. 桂林理工大學(xué)南寧分校，廣西 南寧 530000）

細(xì)胞間粘附分子5對(duì)抗阿糖胞苷抑制分析

楊和平1，張貴強(qiáng)1，謝榮漢2，喬振虎1，崔香香1，韋英海1

（1. 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530000；2. 桂林理工大學(xué)南寧分校，廣西 南寧 530000）

目的 分析細(xì)胞間粘附分子5（ICAM-5）對(duì)抗阿糖胞苷的抑制作用。方法 將轉(zhuǎn)染ICAM-5基因的PAJU-TLN細(xì)胞株與轉(zhuǎn)染空載體的PAJU-NEO細(xì)胞株分別添加阿糖胞苷培養(yǎng)，并于24 h、48 h與72 h時(shí)觀察兩組細(xì)胞株的形態(tài)變化、存活率與凋亡率。結(jié)果 兩組細(xì)胞株均受到阿糖胞苷一定程度的抑制，與PAJUNEO細(xì)胞株相比，PAJU-TLN細(xì)胞在72 h受到阿糖胞苷抑制的形態(tài)損害較輕，24 h、48 h、72 h的存活率明顯高于PAJU-NEO細(xì)胞株組，且凋亡率低于PAJU-NEO細(xì)胞株組。結(jié)論 ICAM-5在PAJU細(xì)胞表達(dá)后具有對(duì)抗阿糖胞苷抑制的作用，其能減輕細(xì)胞毒性，減少細(xì)胞凋亡，能夠保護(hù)和營養(yǎng)神經(jīng)。

粘附分子5；PAJU細(xì)胞；阿糖胞苷；保護(hù)作用

細(xì)胞間粘附分子5（Intercellular adhesion molecule-5，ICAM-5）是指參與細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的分子之一，是一種表達(dá)于神經(jīng)元的糖蛋白，因其特異性地表達(dá)于端腦內(nèi)，故又被稱作端腦素[1]。臨床研究認(rèn)為，ICAM-5具有促進(jìn)神經(jīng)元生長、營養(yǎng)神經(jīng)、抗神經(jīng)元凋亡的作用，可以對(duì)抗神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損害[2]。而阿糖胞苷（arabinocytidine，Ara-C）是一種作用于細(xì)胞S增殖期的嘧啶類抗代謝藥物，可通過抑制細(xì)胞的DNA合成，來干擾細(xì)胞的增殖，臨床多將該藥應(yīng)用于急性白血病的治療中[3]。但Ara-C對(duì)神經(jīng)元有一定的毒副作用，可能會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，從而影響患者的智力。因此，臨床亟需采取有效措施來解決這一問題。鑒于ICAM-5具具有神經(jīng)元保護(hù)作用，本文就分析ICAM-5具對(duì)抗阿糖胞苷抑制的機(jī)制，現(xiàn)作如下報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）基本器械設(shè)備：無菌操作室、凈化臺(tái)、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡倒置相差光學(xué)顯微鏡（TS100）、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、水純化系統(tǒng)、離心管、培養(yǎng)板、移液管及其他小器械（2）試劑：阿糖胞苷、胎牛血清、青/鏈霉素溶液（100×）、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺（200 mmol/L）、DMEM/F12（體積比1：1）、HEPES（1 mmol/L）、二甲基亞砜、MTT、Hoechst、羊抗人ICAM-5多克隆抗體及兔抗羊異硫氰酸熒光素等；（3）細(xì)胞株：人ICAM-5常表達(dá)的人源性神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)AJU細(xì)胞（PAJU-TLN）、無ICAM-5表達(dá)且轉(zhuǎn)染空載體的人源性神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)AJU細(xì)胞（PAJU-NEO）。

1.2 方法

（1）細(xì)胞維持培養(yǎng)：將PAJU-TLN與PAJU-NEO均置于全培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)，全培養(yǎng)基由青/鏈霉素溶液、HEPES、胎牛血清、L-谷氨酰胺、DMEM等試劑融合而成，PH值為7.3。將上述兩組細(xì)胞株置入全培養(yǎng)基中，并在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3～5d更換培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

（2）建立抑制細(xì)胞增殖模式：根據(jù)操作標(biāo)準(zhǔn)配制抑制培養(yǎng)試劑，以0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，將其置于4℃下避光保存。將備用的阿糖胞苷加入抑制培養(yǎng)液中并作最后配制。將對(duì)數(shù)生長期的PAJU-TLN和PAJU-NEO細(xì)胞株以胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞密度調(diào)整至105個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于準(zhǔn)備好的無菌24孔板中，以兩株細(xì)胞的維持培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h觀察細(xì)胞貼壁及生長情況。分別選取PAJU-TLN與PAJUNEO中生長良好的復(fù)孔3個(gè)，均加入含有阿糖胞苷的抑制培養(yǎng)液培養(yǎng)，連續(xù)觀察到72 h時(shí)細(xì)胞株死亡為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。分別取24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間段，在倒置相差顯微鏡下觀察PAJU-TLN與PAJU-NEO細(xì)胞株的存活情況。然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，以PBS快速洗一遍，加入4%的多聚甲醛固定15～20 min，接著棄去多聚甲醛，再以PBS洗一遍。加入PBST滲透10 min，PBS振洗3次，以5%的BSA封閉30 min。加入羊抗人ICAM-5多克隆抗體，在濕盒37℃感作30 min后，于避光下加入綠色熒光標(biāo)記的兔抗羊異硫氰酸熒光素，在濕盒37℃感作40 min，繼續(xù)避光，于熒光顯微鏡下觀察并照相存檔。

（3）細(xì)胞活性測：以105/孔的密度將PAJU-TLN與PAJU-NEO分別接種于96孔板中，分別在加有阿糖胞苷的抑制培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間段后，各孔分別加入MTT（sigma）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸棄培養(yǎng)液，以二甲基亞砜溶解后，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測吸光度值。

（4）細(xì)胞核凋亡率檢測：將對(duì)數(shù)生長期PAJU-TLN與PAJU-NEO細(xì)胞以104密度接種于24孔板中，分別在加阿糖胞苷的抑制培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h定時(shí)取出，以PBS洗一遍。用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS振洗2次。以1mg/mL的Hoechst 33258（Sigma）避光染色15 min，封片后繼續(xù)避光，于熒光顯微鏡下觀察拍照，并計(jì)算細(xì)胞核的凋亡比例。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

未添加阿糖胞苷時(shí)，PAJU-TLN與PAJU-NEO兩組細(xì)胞株在形態(tài)上無明顯差異；添加阿糖胞苷后，隨著時(shí)間不斷延長兩組細(xì)胞株形態(tài)也在不斷變化（見表1）。至抑制培養(yǎng)72 h，通過更換培養(yǎng)液PAJU-TLN細(xì)胞株可重新增殖傳代，而PAJU-NEO細(xì)胞株全部消亡，無法復(fù)活。

2.2 細(xì)胞存活率與凋亡率

未添加阿糖胞苷時(shí)，兩組細(xì)胞自然生存率基本一致；添加阿糖胞苷后，PAJU-TLN組細(xì)胞24 h、48 h、72 h存活率明顯大于PAJU-NEO組細(xì)胞。正常培養(yǎng)條件下，經(jīng)過Hoechst 33258細(xì)胞核染色，絕大多數(shù)細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光。添加阿糖胞苷前，兩組細(xì)胞凋亡率基本一致。添加阿糖胞苷后，PAJU-TLN組細(xì)胞24 h、48 h、72 h凋亡率明顯小于PAJU-NEO組細(xì)胞。見表2。

表1 兩組細(xì)胞株形態(tài)

表2 兩組細(xì)胞株存活率與凋亡率

3 討 論

目前，臨床雖認(rèn)為ICAM-5具有營養(yǎng)神經(jīng)、抗神經(jīng)元凋亡的作用，但對(duì)其抵抗阿糖胞苷抑制作用尚未見資料報(bào)道。文章便以ICAM-5對(duì)抗阿糖胞苷抑制為論點(diǎn)，進(jìn)行試驗(yàn)分析與論述。通過本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染空載體的PAJU-NEO細(xì)胞株在使用阿糖胞苷后，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，72 h后細(xì)胞幾乎全部死亡；而轉(zhuǎn)染ICAM-5基因的PAJU-TLN細(xì)胞株使用阿糖胞苷后，72 h內(nèi)形態(tài)損害較輕，雖出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，但72 h仍有一半左右的細(xì)胞株存活，且可能繼續(xù)增殖傳代。由此認(rèn)為，ICAM-5確有抵抗阿糖胞苷毒性，對(duì)PAJU細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)源性保護(hù)和營養(yǎng)神經(jīng)作用。

[1] 楊和平,彭 熠,楊力強(qiáng),等.端腦素在缺氧環(huán)境中對(duì)PAJU細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國科技信息,2010,10(10)217-219.

[2] 宋琳衍.癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5、6在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)及意義[J].中國老年學(xué)雜志,2013,11(33):5595-5596.

[3] 劉海龍,曲彥明,黃鉑淵,等.葉酸受體介導(dǎo)的阿糖胞苷抑制髓母細(xì)胞瘤增殖并促其凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中華神經(jīng)外科雜志,2015,31(5):514-518.

本文編輯：劉帥帥

R733.72

B

ISSN.2095-6681.2016.30.075.02