李保國(guó)　張丹丹　李瑞軍　劉廷輝

摘要：為研究金龜子綠僵菌蛋白酶活性與毒力的關(guān)系，以黃粉蟲為試蟲測(cè)定金龜子綠僵菌的毒力，采用Folin-酚試劑法對(duì)其胞外蛋白酶活性進(jìn)行測(cè)定，并分析蛋白酶活性與毒力的關(guān)系。結(jié)果表明，不同菌株的蛋白酶活性差異較大，酶活性與毒力存在一定線性關(guān)系。胞外蛋白酶的活性可作為金龜子綠僵菌毒力判定的指標(biāo)之一。

關(guān)鍵詞：金龜子綠僵菌；胞外蛋白酶；Folin-酚試劑法；黃粉蟲；毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S433.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0166—02

金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是一種廣泛存在的昆蟲寄生真菌，其寄主有200多種，且致病力強(qiáng)、持效期長(zhǎng)、不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)人畜無(wú)害，利用其開發(fā)微生物殺蟲劑具有良好發(fā)展前景。金龜子綠僵菌需要酶分解寄主昆蟲的表皮，以進(jìn)入昆蟲體內(nèi)完成侵染過程。關(guān)于殺蟲真菌胞外酶的研究較多，Kucera等在昆蟲體壁離體培養(yǎng)條件下首次發(fā)現(xiàn)蛋白酶的活性，并指出菌株的蛋白酶活力與其毒力存在關(guān)系。Michael等利用明膠作為唯一碳源、氮源，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌可在平板上分泌一種蛋白酶，眾多學(xué)者利用這一方法測(cè)定胞外蛋白酶含量。樊美珍等利用該方法，以馬尾松毛蟲作為試蟲，測(cè)定球孢白僵菌胞外蛋白酶的產(chǎn)量與毒力的關(guān)系，證實(shí)了其具有相關(guān)性。王剛對(duì)已有研究進(jìn)行了系統(tǒng)性總結(jié)，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌的蛋白酶可作為參考毒力指標(biāo)，雖具有一定可靠性，但不能夸大其作用，應(yīng)謹(jǐn)慎使用。馮光明對(duì)不同來(lái)源的17株球孢白僵菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶活性可作為菌株毒力判定的標(biāo)準(zhǔn)之一，但不能夸大其作用?？梢?，胞外蛋白酶與其毒力判定存在一定關(guān)系，但由于所用試蟲不同，測(cè)定胞外酶的方法也不同，因此結(jié)論具有一定差異。

在蛋白質(zhì)的測(cè)定方面，F(xiàn)olin-酚試劑法比雙縮脲法靈敏100倍、比茚三酮方法靈敏數(shù)倍，且操作簡(jiǎn)單易行，是研究蛋白質(zhì)較為精準(zhǔn)的檢測(cè)方法。黃粉蟲（Tenebrio molitor L.）誘集法是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單的土壤昆蟲病原真菌分離方法。本試驗(yàn)利用Folin-酚試劑法測(cè)定金龜子綠僵菌的胞外蛋白酶活性，利用黃粉蟲幼蟲作為標(biāo)準(zhǔn)試蟲進(jìn)行毒力測(cè)定，探討金龜子綠僵菌胞外蛋白酶活性與毒力的關(guān)系，以期建立標(biāo)準(zhǔn)方法，避免因酶測(cè)定方法和試蟲的不同影響研究結(jié)論。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株及試蟲 供試菌株為金龜子綠僵菌菌株，由北方野外土壤中誘集分離得到并保存。試蟲為黃粉蟲（Tenebrio molitor L.），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，挑選低齡幼蟲進(jìn)行毒力測(cè)定。

1.1.2藥品 吐溫、PDA培養(yǎng)基、SDA培養(yǎng)基、酪氨酸、酪蛋白，F(xiàn)olin-酚試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1孢子懸浮液的配制 配制體積分?jǐn)?shù)為1×10⁸個(gè)/mL的孢子懸浮液：將接種于PDA培養(yǎng)基的金龜子綠僵菌在（25±1）℃下恒溫培養(yǎng)10 d，刮取孢子置于研磨器中充分研磨，加入0.05%吐溫-80無(wú)菌水，倒人已滅菌燒杯中，渦旋振蕩使其充分混勻。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整至指定體積分?jǐn)?shù)。

1.2.2粗酶液的制備 將各菌株1×10⁸個(gè)/mL的孢子懸浮液按1%的量分別接人液體SDA培養(yǎng)基（100 mL液體SDA培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中），以加入0.05%吐溫-80無(wú)菌水的樣品為對(duì)照，于25℃、150 r/min在旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)，按時(shí)取培養(yǎng)物并用濾紙過濾，利用濾液測(cè)定蛋白酶活性。

1.2.3粗酶液蛋白酶含量的測(cè)定 以酪蛋白為底物，利用Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH值8.5）配成10g/L的酪蛋白溶液。取該溶液1 mL并添加待測(cè)酶液1 mL，于37℃反應(yīng)30 min，每個(gè)處理3次重復(fù)。采用2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)。過濾后采用Folin-酚試劑進(jìn)行檢測(cè)，每管加入400μL樣品溶液、2 mL FolinAB混合液（按1：50的比例配制），室溫下靜置10 min后，加入200μL酚試劑并靜置30 min，在650 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以每分鐘催化分解生成1μg酪氨酸的酶量為1個(gè)活性單位（U/mL），用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到不同菌株的胞外蛋白酶活性。

1.2.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)金龜子綠僵菌胞外蛋白酶活性的影響 選取金龜子綠僵菌菌株M11-8-7和M7-5-7，按上述方法培養(yǎng)7 d，每天測(cè)定其胞外蛋白酶活性并記錄。

1.2.5不同菌株胞外蛋白酶活性的測(cè)定 選取6株金龜子綠僵菌，按上述方法培養(yǎng)5 d，測(cè)定其胞外蛋白酶活性并記錄。

1.2.6金龜子綠僵菌對(duì)黃粉蟲幼蟲致病力的初步測(cè)定 將接種于PDA培養(yǎng)基的金龜子綠僵菌菌種置于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)10 d，刮取孢子置于研磨器中充分研磨，采用0.05%吐溫-80無(wú)菌水配制成體積分?jǐn)?shù)為1×10⁸個(gè)/mL的孢子懸浮液。用紗布包裹黃粉蟲幼蟲，在菌液中浸泡3 s后取出，對(duì)照組采用等量0.05%吐溫-80無(wú)菌水。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭試蟲。在飼養(yǎng)條件下連續(xù)觀察10 d，每天記錄試蟲的死亡數(shù)，并采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），y為吸光度D_650nm，x為蛋白酶活性，以每分鐘催化分解生成μg酪氨酸的酶量為1個(gè)活性單位（U/mL）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.011 3x+0.083 6，r²=0.983 5。

2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胞外蛋白酶活性的影響

連續(xù)7 d測(cè)定金龜子綠僵菌M11-8-7、M7-5-7菌株的蛋白酶活性（圖2）。胞外蛋白酶活性在前幾天呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，于5 d達(dá)到最大值，之后有所下降；因此，測(cè)定酶活性與毒力的關(guān)系時(shí)，選用培養(yǎng)5 d的培養(yǎng)物。

2.3 6株金龜子綠僵菌的蛋白酶活性和毒力

由酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到6種菌株的蛋白酶活性，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析。相關(guān)性分析結(jié)果（表1）表明，不同菌株產(chǎn)生的蛋白酶活性具有顯著差異。以黃粉蟲作為試蟲進(jìn)行毒力測(cè)定，利用DPS軟件分析數(shù)據(jù)。由表2可知，金龜子綠僵菌M7-5-7、M8-5-83、M8-6-291菌株的蛋白酶活性較弱，毒力較差；M7-10菌株的蛋白酶活性強(qiáng)，毒力也相對(duì)較強(qiáng)。對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析表明，金龜子綠僵菌的蛋白酶活性y₁與致死中時(shí)的自然對(duì)數(shù)x₁存在線性函數(shù)關(guān)系：y=47.79-12.19x，r²=0.8978?？梢?，金龜子綠僵菌的蛋白酶活性與毒力存在較強(qiáng)的線性相關(guān)性，可將蛋白酶活性作為判斷菌株毒力強(qiáng)弱的指標(biāo)。

3結(jié)論與討論

金龜子綠僵菌的侵染過程須破壞昆蟲表皮，蛋白酶是破壞昆蟲體壁的重要物質(zhì)之一。昆蟲表皮成分中含60%～80%蛋白質(zhì)，殺蟲真菌對(duì)蛋白質(zhì)的分解成為其侵染昆蟲的重要條件之一，因此蛋白酶的活性強(qiáng)弱是判定殺蟲真菌侵染昆蟲能力的重要指標(biāo)。Folin-酚試劑檢測(cè)酪氨酸比明膠-瓊脂平板法、雙縮脲法、紫外分光光度法等其他檢測(cè)方法更加精確可靠，為檢測(cè)殺蟲真菌分泌的蛋白酶活性提供了良好平臺(tái)。黃粉蟲是常用于誘集土壤金龜子綠僵菌的昆蟲，具有一定代表性，以黃粉蟲作為試蟲可更好地研究金龜子綠僵菌胞外蛋白酶活性與毒力的關(guān)系。

金龜子綠僵菌分泌胞外蛋白酶具有明顯的時(shí)間動(dòng)態(tài)，研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)5 d時(shí)2株菌的胞外蛋白酶活性最高，之后有所下降，這可能與培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)含量有關(guān)。根據(jù)該結(jié)果選擇在培養(yǎng)5 d時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，以準(zhǔn)確揭示菌株的胞外蛋白酶活性。然而，不同條件下、不同菌株分泌胞外蛋白酶的時(shí)間動(dòng)態(tài)特性尚有待進(jìn)一步研究。

蛋白酶活性與金龜子綠僵菌的侵染能力具有一定線性關(guān)系，若金龜子綠僵菌所產(chǎn)的胞外蛋白酶活性強(qiáng)，其毒力也相對(duì)較強(qiáng)；若胞外蛋白酶活性弱，其毒力也相對(duì)較弱。胞外蛋白酶活性不僅可作為球孢白僵菌毒力強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)因子，還可作為金龜子綠僵菌毒力評(píng)判的重要指標(biāo)。由試驗(yàn)結(jié)果y=47.79-12.19x，r²=0.897 8可知，胞外蛋白酶活性與毒力的正相關(guān)性不高，表明影響毒力的因素很多，包括侵入過程中幾丁質(zhì)酶、脂酶等其他酶的作用，以及侵入后更為復(fù)雜的毒理過程；因此，以酶的活性作為毒力指標(biāo)時(shí)應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度。劉智輝等認(rèn)為胞外酶的活性應(yīng)在一定條件下使用，或作為大量菌株初篩工作的參考指標(biāo)。

本研究方法是對(duì)此方面研究的一次嘗試，試驗(yàn)方法不同、相同菌株對(duì)不同試蟲毒力的差異均會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)論。本研究采用Folin-酚試劑法，以黃粉蟲作為標(biāo)準(zhǔn)試蟲，統(tǒng)一金龜子綠僵菌胞外蛋白酶活性與毒力相關(guān)性的研究方法，避免因試驗(yàn)方法、試蟲的不同而產(chǎn)生不同結(jié)論。