陳曉天，　李俊卿，　宋元達(dá)*（.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫4；.鄭州綠葉堂本草科技有限公司，河南鄭州450000）

?

栗殼抑菌物質(zhì)的提取及其抑菌作用的研究

陳曉天1，李俊卿2，宋元達(dá)*1
（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.鄭州綠葉堂本草科技有限公司，河南鄭州450000）

摘要：研究了栗殼提取物中抑菌物質(zhì)的主要成分及其對常見食品污染菌的抑制作用，并且在食品體系中進(jìn)行了初步防腐試驗。以MCI為填料，采用柱層析法對栗殼粗提物進(jìn)行初步分離，采用瓊脂擴(kuò)散法和常量肉湯稀釋法考察栗殼提取物對4種細(xì)菌及2種霉菌的抑制作用。結(jié)果表明，栗殼提取物種主要抑菌成分可能為可水解單寧，栗殼單寧對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌均有較明顯的抑制作用，最低殺菌質(zhì)量濃度為0.062 5～2.5 mg/mL，對黑曲霉，青霉孢子的最低殺菌質(zhì)量濃度為20～40 mg/mL，對霉菌菌絲無抑制作用。食品防腐實驗表明，同等質(zhì)量濃度的栗殼單寧對蘋果汁的防腐效果與苯甲酸鈉基本相同。

關(guān)鍵詞：栗殼；單寧；抗菌；最低殺菌濃度；蘋果汁

栗殼為殼斗科植物栗（Castanea mollissima Blume）的外果皮，約占栗實質(zhì)量的10%，栗殼含有酚類、有機(jī)酸、多糖、黃酮、內(nèi)酯、香豆素、植物甾醇和單寧等化學(xué)成分。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，至2009年底，我國板栗產(chǎn)量約為109萬噸，約占世界總產(chǎn)量的77%[1]，但隨之產(chǎn)生的板栗殼卻未得到有效利用，所以挖掘板栗殼的應(yīng)用價值很有意義。

國際上，食品防腐劑正朝著安全、天然、營養(yǎng)、多功能的方向發(fā)展[2]，而目前在食品工業(yè)中卻以苯甲酸、山梨酸及其鹽類和對羥基苯甲酸酯類的人工合成防腐劑使用最為廣泛，但經(jīng)長期研究發(fā)現(xiàn)，這些人工合成防腐劑的超量和超范圍使用對人體存在一定的毒副作用及慢性傷害[3]。周國燕等[4]發(fā)現(xiàn)栗殼中的黃酮類色素對細(xì)菌和霉菌有一定抑制作用，魯曉翔等[5]對板栗殼多酚的最佳提取工藝進(jìn)行了探討，在料液質(zhì)量體積比1 g∶23 mL（30%乙醇溶液），70℃水浴振蕩提取多酚，得率可達(dá)7.9%。栗殼中含有的酚類、有機(jī)酸、黃酮、單寧等化學(xué)成分具有作為天然防腐劑開發(fā)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

作者首先采用柱色譜法對栗殼的乙醇粗提物進(jìn)行了初步分離，發(fā)現(xiàn)主要抗菌物質(zhì)可能為可水解單寧。在此基礎(chǔ)上，選擇了體積分?jǐn)?shù)50%丙酮提取栗殼單寧，并進(jìn)行了栗殼單寧對常見食品污染菌的抑菌作用研究，為開發(fā)栗殼作為天然防腐劑提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、黑曲霉（Aspergillus niger）、桔青霉（Penicillium citrinum）：江南大學(xué)生物技術(shù)中心提供；MCI柱（CHP20/P120）：三菱化學(xué)公司產(chǎn)品。

ZHJH-1029C垂直流超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；ZHTY-70振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海勒頓實業(yè)有限公司產(chǎn)品；DFT-50型高速萬能粉碎機(jī)：上海新諾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2實驗方法

1.2.1栗殼抑菌物質(zhì)有效成分的定性確定取干燥至恒重的板栗殼20 g，用200 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇于室溫浸泡24 h，提取2次，抽濾，蒸發(fā)后所得浸膏用水溶解，上MCI柱，分別用500 mL水，體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%、70%的甲醇溶液及無水甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮，進(jìn)行抑菌實驗。

對抑菌活性最強(qiáng)的洗脫液部位進(jìn)行定性實驗[6]，初步明確抗菌物質(zhì)種類。

1.2.2栗殼單寧的提取取干燥至恒重的粉碎后栗殼20 g，用200 mL體積分?jǐn)?shù)50%丙酮溶液[7]于室溫浸泡24 h，浸提2次，抽濾，濃縮至干，于4℃冰箱保存。

1.2.3抑菌實驗

1）供試菌懸液的制備將供試菌種活化后，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)12～18 h，真菌于28℃培養(yǎng)48 h，制備初始菌懸液及孢子懸液。以無菌生理鹽水對菌懸液進(jìn)行稀釋，控制培養(yǎng)時細(xì)菌終濃度5×105cfu/mL，真菌孢子濃度（0.4～5.0）×104cells/mL[8]。

2）抑菌效力的評價細(xì)菌：采用瓊脂擴(kuò)散法[9]，涂布菌液后用6 mm打孔器于培養(yǎng)基上打孔，孔中加入100 μL 0.01 g/mL栗殼單寧提取液，于37℃培養(yǎng)12 h，十字交叉法測量抑菌圈直徑，以無菌水作為對照空白對照，100 mg/mL苯甲酸鈉作為陽性對照，重復(fù)3次，取均值。

真菌：采用生長速率法[10]，用打孔器取菌落邊緣生長旺盛的菌絲移入含有10 mg/mL提取物的查氏培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)，待對照組菌落生長接近培養(yǎng)皿邊緣時，測定實驗組菌落直徑，計算抑制率，重復(fù)3次，取均值，以無菌水作為對照空白對照，100 mg/mL苯甲酸鈉作為陽性對照。

菌絲生長抑制率=（對照組菌落直徑-實驗組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%

3）最低殺菌濃度（MBC）的測定最低殺菌濃度測定采用常量肉湯稀釋法，取含有1 mL LB液體培養(yǎng)基的滅菌試管，并取1 mL板栗殼單寧提取液（已過濾除菌）1 mL加入第一支試管，混合均勻后從中吸取1 mL加入第二支試管，再取1 mL加入第3支試管，依次類推，進(jìn)行二倍稀釋，最后一支試管中取1 mL棄去，制成含不同質(zhì)量濃度栗殼提取液的試管。

在上述含不同濃度提取液的試管中接種供試菌液及孢子懸液，細(xì)菌置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)16～20 h，霉菌于28℃培養(yǎng)3 d。取無明顯渾濁的試管涂布平板，于37℃培養(yǎng)18～24 h，無菌落生長的平板對應(yīng)的最低提取液濃度定義為最低殺菌濃度；觀察接種孢子懸液對應(yīng)試管，無霉菌生長的試管對應(yīng)的提取液濃度定義為最低殺菌濃度。

1.2.4蘋果汁防腐實驗取新鮮蘋果，洗凈，去皮，榨汁，分裝于滅菌三角瓶中，每瓶100 mL。向三角瓶中加入質(zhì)量濃度0.05 g/dL的栗殼單寧提取液，對照組加入0.05 g/dL的苯甲酸鈉，分裝于無菌試管中，以蘋果汁原液為空白對照，37℃下放置，分別于3，6，9，12，15 d測定菌落總數(shù)[13]，所有操作均在無菌下進(jìn)行，重復(fù)3次[11]。

2　結(jié)果與分析

2.1栗殼抑菌物質(zhì)的確定

栗殼中抑菌成分為中高極性物質(zhì)，MCI柱為聚苯乙烯基的反相樹脂填料，主要用于分離中高極性物質(zhì)，將體積分?jǐn)?shù)95%乙醇栗殼粗提液裝柱，用不同體積分?jǐn)?shù)甲醇進(jìn)行洗脫，濃縮并檢測抑菌效果。不同洗脫液部位對4種供試菌的抑菌圈大小見表1，其中體積分?jǐn)?shù)30%甲醇洗脫液對4種供試細(xì)菌的抑菌圈直徑大于其它洗脫部位，抑菌效果最強(qiáng)，說明主要抗菌物質(zhì)集中于體積分?jǐn)?shù)30%甲醇洗脫液。

表1　不同洗脫液對細(xì)菌的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone size by different eluent　mm

對體積分?jǐn)?shù)30%甲醇洗脫液部位進(jìn)行定性實驗，結(jié)果如表2所示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%三氯化鐵溶液顯藍(lán)黑色證明存在酚類物質(zhì)；明膠沉淀反應(yīng)顯陽性，證明有單寧存在；飽和溴水、飽和石灰水及稀鹽酸共沸實驗進(jìn)一步證明所含單寧為可水解單寧，推測栗殼中可水解單寧可能為主要抗菌成分。

表2　體積分?jǐn)?shù)30%洗脫液定性實驗結(jié)果Table 2 30% methanol eluent qualitative results

2.2栗殼單寧的提取

丙酮-水體系對單寧溶解能力最強(qiáng)，能夠打開單寧-蛋白質(zhì)的連接鍵，且與單寧無溶劑化作用，減壓蒸發(fā)易除去，提取效率高，是目前使用最普遍的溶劑體系[12]，所以在推測栗殼中主要抗菌成分為單寧后，后續(xù)提取采用丙酮作為溶劑。20 g栗殼經(jīng)體積分?jǐn)?shù)50%丙酮-水提取后得1.1 g干浸膏，得率5.5%，配制10 mg/mL的栗殼單寧提取液。

2.3栗殼單寧抑菌實驗結(jié)果

2.3.1栗殼單寧提取液對細(xì)菌的抑制作用以抑菌圈直徑和最低殺菌濃度（MBC）為評價指標(biāo)，通過瓊脂擴(kuò)散法及常量肉湯稀釋法測定栗殼單寧對四種供試菌的抑制作用，實驗結(jié)果見表3，可見10 mg/ mL的栗殼單寧提取液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果要強(qiáng)于化學(xué)防腐劑苯甲酸鈉。

2.3.2栗殼單寧提取液對真菌的抑菌效果以菌絲生長抑制率和最低殺菌濃度（MBC）為評價指標(biāo)，通過生長速率法及常量肉湯稀釋法測定栗殼單寧對兩種供試霉菌菌絲及孢子的抑制作用（表4）。實驗結(jié)果表明，10 mg/mL的栗殼單寧對霉菌菌絲生長無抑制作用；對黑曲霉、桔青霉孢子的最低殺菌濃度為40和20 mg/mL，抑菌效果要弱于苯甲酸鈉，說明栗殼單寧提取物對霉菌的抑制效果較差。

表3　栗殼單寧對4種細(xì)菌的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of chestnut shell tannin on 4 kinds of bacteria

表4　栗殼單寧對2種真菌的抑制作用Table 4　 Inhibitory effect of chestnut shell tannin on 2 kinds of fungi

2.4蘋果汁防腐試驗

蘋果汁在添加同等質(zhì)量濃度下（0.05 g/dL）的栗殼單寧與苯甲酸鈉后，37℃下放置，于3，6，9，12，15 d測定菌落總數(shù)（圖1）。實驗結(jié)果表明，同等質(zhì)量濃度下，栗殼單寧的抑菌效果與苯甲酸鈉基本相同。

圖1　栗殼單寧對蘋果汁的防腐效果Fig. 1　 Antiseptic capacity of chestnut shell tannins in apple juice

3　結(jié)語

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌以及黑曲霉、青霉是食品生產(chǎn)、加工和儲藏過程中常見的污染菌。研究發(fā)現(xiàn)，栗殼中的主要抗菌活性物質(zhì)可能為可水解單寧。栗殼單寧提取物對常見食品污染菌均有一定的抑菌作用，其中對細(xì)菌的抑制作用最顯著，對4種供試細(xì)菌的最低殺菌質(zhì)量濃度為0.062 5～2.5 mg/mL。20～40 mg/mL的單寧提取物對霉菌孢子的萌發(fā)有一定抑制作用，而對霉菌菌絲生長則無抑制作用。

將栗殼單寧提取物應(yīng)用于蘋果汁中，發(fā)現(xiàn)在同等質(zhì)量濃度下抑菌效果與化學(xué)防腐劑苯甲酸鈉基本相同，表明栗殼單寧提取物具有作為天然食品防腐劑的潛力[13]。

參考文獻(xiàn)：

[1]張雪丹，張倩，辛力，等.板栗殼的化學(xué)成分及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].落葉果樹，2014，44（1）：20 -22. ZHANG XuedanD，ZHANG Qian，XIN Li，et al. Review on the chemical composition of chestcut shell and it’s application[J]. Deciduous Fruits，2012，44（1）：20 -22.（in Chinese）

[2]尤新.天然營養(yǎng)功能化發(fā)展趨向—美國FDA公布2001年度公認(rèn)安全食品（GRAS）簡析[J].中國食品添加劑，2003（2）：1-4. YOU Xin. Trends on natural，nutient and functional food additives—brief analysis about the safety food（GRAS）released by FDA in 2001[J]. China Food Additives，2003（2）：1-4（in Chinese）

[3]唐春紅.天然防腐劑與抗氧化劑[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2010.

[4]周國燕，桑迎迎，宮春波，等.板栗殼色素的提取工藝優(yōu)化及其抑菌性能[J].食品科學(xué)，2010，31（22）：101-105.ZHOU Guoyan，SANG Yingying，GONG Chunbo，et al. Optimal extraction parameters and antibacterial properties of pigment from Chestnut Shell[J]. Food Science，2010，31（22）：101-105.（in Chinese）

[5]魯曉翔，趙晨光，連喜軍.板栗殼多酚提取條件及其抗氧化性研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：32-35. LU Xiaoxiang，ZHAO Chenguang，LIAN Xijun. Study on the extraction conditions and antioxidition of polyphenol from chestnut-shells[J]. Food Research and Development，2008，29（3）：32-35.（in Chinese）

[6]張國華，桑春燕.鞣質(zhì)的鑒別方法[J].黑龍江科技信息，2009（7）：186. ZHANG Guohua，SANG Chunyan. Identfication of tannins[J]. Heilongjiang Science and Technology Information，2009（7）：186.（in Chinese）

[7]L W WANG. Antibacterial activity of the vegetable extract from chestnut（Castanea mollissima blume）shell[J]. Asian Journal of Chemistry，2011，23（9）：4243-4244.

[8]Araújo. In vitro susceptibility testing of dermatophytes isolated in Goiania，Brazil，against five antifungal agents by broth microdilution method[J]. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo，2009，51（1）：9-12.

[9]陳佳佳，劉凡，廖森泰，等.桑葉提取物抑菌活性及抑菌穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（9）：88-91. CHEN Jiajia，LIU Fan，LIAN Sentai，et al. Study on antibacterial activity and stability of extracts from mulberry（Morus alba L.）leaves[J]. Science and Technology of Food Industry，2012，33（9）：88-91.（in Chinese）

[10]劉國坤，陳啟建，吳祖建，等.幾種植物提取物對4種植物病原真菌的抑制作用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2004，33（3）：295-299. LIU Guokun，CHEN Qijian，WU Zujian，et al. Inhibition of plantextracts against plantpathogenic fungi[J]. Journal of Fujian Agriculture and Foresty University（Natural Science Edition），2004，33（3）：295-299.（in Chinese）

[11]ZENG Weicai，HE Qiang，SUN Qun，et al. Antibacterial activity of water-soluble extract from pine needles of Cedrus deodara[J]. International Journal of Food Microbiology，2012（153）：78-84.

[12]徐勤.鞣質(zhì)的研究進(jìn)展[J].華夏醫(yī)學(xué)，2004，17（1）：113-115. XU Qing. Research progress on tannins[J]. Acta Medicinae Sinica，2004，17（1）：113-115.（in Chinese）

[13]徐進(jìn)，趙聲蘭，陳朝銀，等.細(xì)菌抗單寧作用機(jī)制及其意義[J].生物學(xué)雜質(zhì)，2008，25（4）：4-6. XU Jin，ZHAO Shenlan，CHEN Chaoyin，et al. The resistant mechanism and significance of bacteria to tanins[J]. Tournal of Biology，2008，25（4）：4-6.（in Chinese）

Extraction and Antimicrobial Activity Assay of Bioactive Compounds from Chestnut Shell

CHEN Xiaotian1，LI Junqing2，SONG Yuanda*1
（1. School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. Zhengzhou lvyetown Technology Co. Ltd，Zhengzhou 450000，China）

Abstract：The bioactive component of chestnut shell and its inhibitory effect on the food-borne microbes were studied，and preliminary test of its preservation function was carried out in a food system. The chestnut shell crude extracts were separated by MCI column and the inhibitory effects were investigated via agar diffusion method and macrodilution broth method on four bacteria and two fungi. Column separation showed that the activity component of chestnut shell is hydrolysable tannin，in vitro antimicrobial assay showed that chestnut shell tannin possesses a remarkable antimicrobial activity against tested food-borne microbes including Escherichia coli，Staphyloccocus aureus，Bacillus subtilis，Salmonella typhimurium，Aspergillus niger，Penicillium citrinum with the minimum bactericidal concentration（MBC）values in the ranges of 0.062 5～2.5 mg/mL on bacteria and 20～40 mg/mL on fungal spores，but with no inhibitory effect on fungal hyphae. Food preservation experiment indicated that the chestnut shell tannins have a basically identical antiseptic capacity than sodium benzoate in apple juice.

Keywords：chestnut shell，tannins，antimicrobial，MBC，apple juice

*通信作者：宋元達(dá)（1964—），男，江蘇南通人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物生物合成與提取研究。E-mail：493375956@qq.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31271812）。

收稿日期：2014-08-29

中圖分類號：S 664

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0054—05