微波輔助合成硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖的研究

張　玨，　沈　潔，　隋曉辰，　劉昱均（.衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無(wú)錫4063；.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)/江南大學(xué)，化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫4）

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微波輔助合成硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖的研究

張玨1，沈潔2，隋曉辰2，劉昱均2
（1.衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無(wú)錫214063；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)/江南大學(xué)，化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

摘要：多糖的硫酸化修飾能提高多糖的生物活性。從靈芝深層發(fā)酵液中獲取靈芝胞外多糖，以二甲基甲酰胺為反應(yīng)溶劑，采用氨基磺酸為酯化劑，探討了微波輔助加熱合成多糖的途徑。結(jié)果表明，將尿素作為催化劑微波輔助合成硫酸酯化多糖，反應(yīng)條件溫和，取代度可高達(dá)2.67。因此微波輔助合成法為獲取高取代度硫酸化靈芝多糖開(kāi)辟了一條新途徑。

關(guān)鍵詞：靈芝；多糖；硫酸化；發(fā)酵

靈芝多糖為靈芝中最重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[1-3]。隨著現(xiàn)代生物工程技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)液態(tài)深層發(fā)酵可規(guī)?；ㄏ颢@取靈芝多糖[4-5]。但發(fā)酵靈芝胞外多糖的抗腫瘤活性卻并不理想[6]。為解決這一問(wèn)題，通過(guò)多糖的硫酸化修飾來(lái)提高多糖的生物活性[7-9]。研究表明，靈芝胞外多糖經(jīng)硫酸化修飾后其抗肝癌活性明顯提高，且硫酸化取代度（DS）與其生物活性密切相關(guān)[10-13]。目前對(duì)靈芝多糖硫酸化修飾的研究多集中于子實(shí)體多糖[14-15]，關(guān)于發(fā)酵靈芝多糖硫酸化的報(bào)道相對(duì)較少[8]。在多糖硫酸化工藝上多采用氯磺酸酯化法[12，16-17]，并且以傳統(tǒng)的常規(guī)加熱方式來(lái)提供能量，這就帶來(lái)了反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、副反應(yīng)多、取代度較?。―S=0.8-1.5）等弊端[10，12，18-19]。對(duì)于合成高取代度的硫酸酯化多糖的報(bào)道更為少見(jiàn)[20]，另外以氨基磺酸作為酯化試劑的報(bào)道也相對(duì)較少[21]。

微波輔助合成技術(shù)利用微波替代傳統(tǒng)的加熱方式，可降低反應(yīng)活化能，提高反應(yīng)速率，具有高轉(zhuǎn)化率、高選擇性、低能耗、清潔環(huán)保等特點(diǎn)[22]。作者采用微波輔助合成法對(duì)靈芝胞外多糖進(jìn)行硫酸化修飾，考察各因素對(duì)取代度的影響，旨在得到一條高效、可控、取代度高、反應(yīng)條件溫和的多糖硫酸化合成途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

發(fā)酵靈芝胞外多糖：江南大學(xué)章克昌教授實(shí)驗(yàn)室提供；無(wú)水硫酸鈉、N，N-二甲基甲酰胺、苯酚、吡啶、濃硫酸、乙醇、氯化鋇、氫氧化鈉、甲酰胺、氨基磺酸：AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；明膠：Amresco生物科技有限公司產(chǎn)品；氯磺酸：CP，上海金山亭化工試劑廠產(chǎn)品。

微波催化合成萃取儀：XH-100A，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)：T-6，普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；透析袋：截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500，美國(guó)Viskase公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)：EZ585Q，美國(guó)FTS System公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52，上海本波儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1硫酸酯化靈芝胞外多糖的制備流程將一定量的靈芝胞外多糖加入裝有二甲基甲酰胺的燒瓶中，室溫下攪拌30 min使多糖均勻分散在溶劑中。將燒瓶放入微波反應(yīng)器中，選擇恒溫模式，一定溫度下預(yù)熱30 min后緩慢加入氨基磺酸，設(shè)置反應(yīng)所需的微波功率。反應(yīng)結(jié)束后迅速將燒瓶置于冰水浴中，反應(yīng)液用4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7后用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇沉淀，離心取沉淀。沉淀先用90%乙醇洗滌再用去離子水復(fù)溶，用流水透析24 h。透析袋內(nèi)液體冷凍干燥后即得靈芝胞外硫酸化多糖。

1.2.2硫酸基含量測(cè)定：采用BaCl2-明膠濁度法采用BaCl2-明膠濁度法[23]，取代度（DS）計(jì)算公式：

DS=（1.62×S）/（32－1.02×S），其中S%為硫質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2　結(jié)果與討論

2.1硫酸酯化試劑的篩選

硫酸基團(tuán)的引入影響著多糖的生物活性，硫酸酯化試劑則對(duì)反應(yīng)有一定的影響。作者分別考察了氯磺酸和氨基磺酸對(duì)取代度的影響。

從圖1可看出，氯磺酸和氨基磺酸在各自最佳反應(yīng)溫度下的取代水平相似，但氨基磺酸對(duì)反應(yīng)溫度更為寬泛。相比用氯磺酸合成的硫酸酯化靈芝多糖，氨基磺酸法合成的硫酸酯化靈芝多糖色澤較淺，反應(yīng)過(guò)程溫和。

圖1　不同硫酸酯化試劑對(duì)DS的影響Fig. 1 Effectof sulfuric acid esterification reagent on DS

2.2微波輔助合成對(duì)取代度的影響

氨基磺酸是一種溫和的硫酸酯化試劑。在微波合成反應(yīng)中，通過(guò)極性分子的偶極旋轉(zhuǎn)和離子傳導(dǎo)兩種作用將能量直接傳遞到反應(yīng)物上。同時(shí)，分子的整體運(yùn)動(dòng)能夠活化分子，有利于其形成過(guò)渡態(tài)，從而降低反應(yīng)體系的活化能，最終使反應(yīng)速率加快，選擇性提高。

微波輻射對(duì)多糖硫酸酯化的影響見(jiàn)圖2。采用微波法合成硫酸酯化多糖具有反應(yīng)時(shí)間短，轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)。但這也提高了對(duì)溫度的選擇性。溫度過(guò)低（＜80℃）不利于反應(yīng)充分進(jìn)行，而溫度過(guò)高（＞90℃）則導(dǎo)致氨基磺酸分解，同樣降低了取代度。反應(yīng)溫度為90℃時(shí)，多糖硫酸化的取代度達(dá)到最大為1.37，并且產(chǎn)物顏色較淺，說(shuō)明副產(chǎn)物較少。因此，作者選取90℃為最佳的合成溫度。

圖2　微波輻射溫度對(duì)靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響Fig. 2 Effect of reaction temperature on DS

2.3微波輻射功率對(duì)取代度的影響微波輻射功率通過(guò)影響體系的溫度和反應(yīng)初速度來(lái)影響反應(yīng)的取代度。由圖3可知，微波功率在100～300 W時(shí)，微波提供的能量較低，體系僅處于微波輻射加熱狀態(tài)，無(wú)法有多余的能量傳遞到反應(yīng)分子上使其活化。當(dāng)微波功率高于400 W時(shí)，體系能維持最適反應(yīng)溫度90℃，并有一定的能量傳遞到反應(yīng)分子上，且在一定范圍內(nèi)取代度隨功率增加而增大。當(dāng)功率超過(guò)500 W時(shí)，硫酸酯化胞外多糖的取代度有所增加但并不顯著。這可能是由于過(guò)大的功率導(dǎo)致反應(yīng)溫度上升，從而不利于取代度的提高。綜上所述，500 W為最佳的微波輻射功率。

圖3　微波輻射功率對(duì)靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響Fig. 3 Effect of microwave radiation power on DS

2.4微波輻射時(shí)間對(duì)取代度的影響

微波輻射時(shí)間對(duì)靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響見(jiàn)圖4。在微波功率為500 W、輻射時(shí)間超過(guò)120 s時(shí)，靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度明顯提高。但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，取代度并未明顯增大?？紤]到微波輻射下各底物偶極矩的強(qiáng)烈變化可能對(duì)反應(yīng)物和產(chǎn)物的穩(wěn)定性帶來(lái)不確定因素。并且反應(yīng)時(shí)間過(guò)短不利于反應(yīng)充分進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則加劇氨基磺酸分解。故選取微波輻射反應(yīng)時(shí)間為240 s。

圖4　微波輻射時(shí)間對(duì)靈芝胞外多糖硫酸酯化取代度的影響Fig. 4 Effect of microwave radiation time on DS

2.5反應(yīng)物料摩爾比及催化劑在微波輔助合成中對(duì)取代度的影響

在微波輔助合成反應(yīng)物中，反應(yīng)物的分子極性越大，偶極旋轉(zhuǎn)越強(qiáng)，產(chǎn)生的熱量也越大，從而提高了微波的效能作用，由此增大了反應(yīng)體系中反應(yīng)物分子的碰撞頻率或有效碰撞的幾率。因此，有必要探討微波合成中多糖與氨基磺酸的摩爾比。此外，催化劑的存在也是影響酯化反應(yīng)速率的重要因素。微波輻射在加速多糖的氨基磺酸酯化速率的同時(shí)也不可避免地導(dǎo)致氨基磺酸的分解。而尿素的加入能有效緩解這一問(wèn)題。在微波輻射反應(yīng)中將尿素作為催化劑不僅加快了反應(yīng)速率，提高硫酸酯化多糖的取代度，還提高了氨基磺酸的利用率。

從圖5結(jié)果可看到，在沒(méi)有催化劑的情況下，多糖與氨基磺酸摩爾比的增大使得取代度略有增加。當(dāng)物料摩爾比為1∶3時(shí)，對(duì)應(yīng)的取代度為1.5。將尿素作為催化劑，物料摩爾比超過(guò)1∶2時(shí)，取代度明顯增大。這表明在微波場(chǎng)中，尿素的催化性能得到顯著提高，有效提高了底物轉(zhuǎn)化率。并且在反應(yīng)時(shí)間僅為4 min時(shí)獲得的硫酸化靈芝胞外多糖的取代度高達(dá)2.63，高于目前已有文獻(xiàn)所報(bào)道的取代度。

圖5　尿素在微波輔助合成硫酸酯化靈芝胞外多糖取代度的影響Fig. 5 Effect of urea under microwave radiation on DS

3　結(jié)語(yǔ)

以氨基磺酸為硫酸化試劑，對(duì)微波輔助合成硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖的工藝條件進(jìn)行了探討。由此獲得最佳工藝條件為：微波輔助反應(yīng)溫度為90℃，反應(yīng)時(shí)間為4 min，微波功率為500 W，物料比（多糖的單糖殘基與氨基磺酸摩爾比）為1∶3，催化劑尿素的用量為氨基磺酸質(zhì)量的25%。在該條件下獲得的硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖的取代度高達(dá)2.67。并且該反應(yīng)快速溫和、易控制。由此可見(jiàn)，微波輔助法合成硫酸化多糖是一種易于規(guī)?；?、能獲取高取代度的合成方法。

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Microwave Assisted Synthesis of Sulfated Extracellular Polysaccharide from Submerged Fermentation of Ganoderma Lucidum

ZHANG Jue1，SHEN Jie2，SUI Xiaochen2，LIU Yujun2
(1. Key Laboratory of Nuclear Medicine of Ministry of Health / Jiangsu Institute of Nuclear Medicine，Wuxi 214063，China；2 State Key Laboratory of Food Science and Technology / School of College of Chemical & Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：Sulfation of polysaccharides can improve their biological activities. To efficiently prepare the sulfated extracellular polysaccharide from submerged fermentation of Ganoderma Lucidum，microwave assisted synthesis was established in this paper，using dimethylformamide as solvent and aminosulfonic acid as esterifying reagent. Results showed that the microwave assisted synthesis with urea as catalyst led to a high substitution degree of 2.67，and the reaction was mild. Thus，microwave assisted synthesis is a new approach to obtain sulfated polysaccharides with high degree of substitution.

keywords：Ganoderma Lucidum，polysaccharide，sulfation，submerged fermentation

作者簡(jiǎn)介：張玨（1969—），女，上海人，工學(xué)博士，副研究員，主要從事天然產(chǎn)物提取研究。E-mail：zhangjue@jsinn.org

基金項(xiàng)目：中央高校自主科研項(xiàng)目（JUSRP11517）；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索基金項(xiàng)目（SKLF-ZZB-201504）；無(wú)錫市科技支撐計(jì)劃—社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（CSE01N1239）。

收稿日期：2014-08-08

中圖分類號(hào)：O 657.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）01—0107—05