曲高婷，張愛青，施會敏，甘衛(wèi)華

(南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院　兒科，江蘇　南京　210003)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學·

自噬對體外醛固酮誘導的大鼠系膜細胞凋亡的影響

曲高婷，張愛青，施會敏，甘衛(wèi)華

(南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京210003)

【摘要】目的：通過體外研究醛固酮(ALD)和蟾蜍靈(Bufalin)作用于大鼠系膜細胞后自噬與凋亡的變化,探討自噬在醛固酮誘導系膜細胞凋亡中的作用，進而說明醛固酮參與腎損傷的可能機制。 方法：體外培養(yǎng)大鼠系膜細胞,分別應用醛固酮、蟾蜍靈、氯喹(CQ)作用于系膜細胞,實驗分為a：對照組、b:ALD組(10-6mol/L 醛固酮)，c：Bufalin組(10-8mol/L 蟾蜍靈)，d：ALD+Bufalin組(10-6mol/L 醛固酮+10-8mol/L 蟾蜍靈)，e:ALD+CQ組(10-6mol/L 醛固酮+10 μmol /L氯喹)，f:ALD+Bufalin+CQ組(10-6mol/L 醛固酮+10-8mol/L 蟾蜍靈+10 μmol /L氯喹)；應用透射電鏡觀察各組大鼠系膜細胞的自噬水平；應用Western Blot檢測各組自噬標志蛋白P62、LC3表達的變化；應用An- nexin V /PI 雙染流式細胞術(shù)檢測各組大鼠系膜細胞凋亡的變化。 結(jié)果：透射電鏡下:a組和c組未見典型自噬體，b組可見典型自噬體，d組自噬體數(shù)目小于b組，e組、f組自噬體數(shù)目均明顯高于各組；Western Blot檢測P62、LC3蛋白表達結(jié)果顯示：c組表達量與a組基本相同，b組較a、c組升高(P<0.05)；d組較b組下降(P<0.05)；e組、f組表達量基本相當，且顯著高于各組(P<0.05)；流式細胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示:c組細胞凋亡率(46.23±5.83)%與a組(46.10±3.49)%基本相同，b組細胞凋亡率(76.47±3.03)%較a組明顯升高(P<0.05),d組(61.73±2.76)%、e組(61.03±3.62)%、f組細胞凋亡率(60.50±1.95)%基本相同，較a、c組明顯升高(P<0.05)，但較b組下降(P<0.05)。 結(jié)論：醛固酮可同時誘導系膜細胞自噬及凋亡增加，蟾蜍靈及氯喹可以抑制醛固酮對自噬及細胞凋亡的誘發(fā)作用，提示自噬可促進醛固酮誘發(fā)的系膜細胞凋亡，醛固酮可能通過增加自噬從而促進系膜細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】醛固酮;蟾蜍靈；系膜細胞;自噬;凋亡

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.02.003

醛固酮(aldosterone，ALD)是引起腎損傷的重要物質(zhì)，它可通過作用于腎臟固有細胞發(fā)揮作用。系膜細胞是腎小球內(nèi)最活躍的固有細胞，其數(shù)量、形態(tài)及位置的相對穩(wěn)定直接影響著腎臟正常結(jié)構(gòu)和功能的維持，其受損可促進腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明醛固酮可直接誘導系膜細胞凋亡，可能是醛固酮引起的腎損傷的機制之一[1]，但醛固酮如何調(diào)節(jié)細胞凋亡的機制尚不清楚。近年來，多項研究表明細胞自噬與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，且自噬與細胞凋亡間有著密不可分且錯綜復雜的關(guān)系，自噬既可誘導凋亡，又可拮抗凋亡的發(fā)生[3]。因此，本研究通過觀察醛固酮，蟾蜍靈及自噬抑制劑氯喹分組作用于大鼠系膜細胞后，細胞自噬與凋亡的變化，探討系膜細胞自噬與凋亡間的關(guān)系，并為臨床應用醛固酮受體拮抗劑和蟾蜍靈治療腎臟疾病提供相應實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要實驗材料和儀器正常大鼠腎小球系膜細胞株[中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)]；胎牛血清、0.25% 含EDTA的胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液(Gibco，美國)；醛固酮、蟾蜍靈、氯喹(Sigma，美國)；β-actin抗體(Bioworld，美國)；P62抗體、LC3抗體(Sigma，美國)；HRP-標記的羊抗兔二抗、HRP-標記的羊抗小鼠二抗(CST，美國)；蛋白Marker(Thermo，加拿大)；透射電子顯微鏡(JEOL，日本)；流式細胞儀(BD,法國)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液(含青霉素 100 U /mL,鏈霉素100 μg /mL ) 中,置于37 °C、 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每 2 天換液,當細胞長至70%～80% 融合時用0.25%的胰酶消化傳代,取第 4～6 代細胞用于實驗。

1.2.2實驗分組將處于對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后,以 2×105個/孔密度接種于6孔板培養(yǎng),當細胞長至 70%～80%融合時換用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細胞生長同步化。實驗分組為a組(對照組)；b組(醛固酮組：醛固酮10-6mol/L,根據(jù)既往研究確定[1])；c組(Bufalin組:蟾蜍靈10-8mol/L,根據(jù)既往研究確定[4])；d組(ALD+Bufalin組:醛固酮10-6mol /L+蟾蜍靈10-8mol/L)；e組(ALD+CQ組:醛固酮10-6mol/L+氯喹10 μmol /L)；f組(ALD+Bufalin+CQ組:醛固酮10-6mol/L+蟾蜍靈10-6mol /L+氯喹10 μmol /L)。

1.2.3透射電子顯微鏡術(shù)細胞生長同步化后,根據(jù)不同分組處理細胞。24 h 后PBS 洗滌細胞3 次，胰酶消化，1500 r/min 離心10 min，使細胞成團，小心吸去上清，加入2.5%戊二醛固定2 h，送電鏡室包埋、切片、染色，透射電子顯微鏡下觀察自噬體的存在。

1.2.4Western Blot 檢測自噬相關(guān)蛋白P62、LC3表達細胞生長同步化后,根據(jù)不同分組處理細胞。24 h 后PBS洗滌細胞3 次，按100∶1 加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑(100 μL+1 μL)，并于冰上裂解30 min，4℃，15 000 r/min 離心10 min，取上清，加入上樣緩沖液，100℃水浴變性10 min。根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。每組按30 μg 蛋白上樣量進行SDS-PAGE 電泳，將電泳分離的樣本轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，加入LC3、P62 及β-actin 一抗(工作液濃度1∶1000)于4℃孵育過夜，1×TBST漂洗一抗，加入相應的HRP 標記的二抗(工作液濃度1∶5000)室溫孵育2 h，1×TBST 漂洗后ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光并顯影。以β-actin 作為內(nèi)參，進行灰度值分析，計算目的蛋白的相對表達量。

1.2.5An-nexin V/PI 雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡根據(jù) An-nexin V-FITC /PI 凋亡檢測試劑盒說明操作。 細胞生長同步化后,根據(jù)不同分組處理細胞。24 h后胰酶消化后收集細胞,用預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次并離心,100 μL 預冷 binding buffer 重懸細胞,加入 5 μL An-nexin V-FITC 和 5 μL PI 混勻,避光室溫反應10 min,加入400 μL binding buffer 終止反應,篩網(wǎng)過濾后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。 BD Accuri C6 軟件分析細胞凋亡。

2結(jié)果

2.1各組大鼠系膜細胞自噬情況比較透射電子顯微鏡下觀察，對照組、Bufalin組未見典型的雙層膜包裹細胞漿及細胞器的自噬體，ALD組可見典型自噬體，ALD+Bufalin組見自噬體但數(shù)目小于ALD組，ALD+CQ組見自噬體且數(shù)目明顯高于ALD組，ALD+Bufalin+CQ組見自噬體且數(shù)目高于ALD+Bufalin組但低于ALD+CQ組。見圖1。

a.對照組；b.ALD組；c.Bufalin組；d.ALD+Bufalin組；e.ALD+CQ組；f.ALD+Bufalin+CQ組。

圖1大鼠系膜細胞自噬的變化

2.2各組自噬相關(guān)蛋白P62和LC3表達比較Western Blot結(jié)果顯示，各組間自噬相關(guān)蛋白P62存在顯著差異(F=480.11，P=0.000)。b組P62蛋白表達較a組明顯升高(P=0.000)；c組P62蛋白表達較a組無明顯變化，d組P62蛋白表達較b組明顯降低(P=0.000)，d組P62蛋白表達較c組顯著升高(P=0.000)，e組P62蛋白表達較b組顯著升高(P=0.000)，f組P62蛋白表達較e組無明顯變化，f組P62蛋白表達較d組顯著升高(P=0.000，圖2A、B)。

Western Blot結(jié)果顯示，各組間自噬相關(guān)蛋白LC3存在顯著差異(F=179.53，P=0.000)。b組LC3蛋白表達較a組明顯升高(P=0.000)；c組LC3蛋白表達較a組無明顯變化，d組LC3蛋白表達較b組明顯降低(P=0.000)，d組LC3蛋白表達較c組顯著升高(P=0.000)，e組LC3蛋白表達較b組顯著升高(P=0.000)，f組LC3蛋白表達較e組無明顯變化，f組LC3蛋白表達較d組顯著升高(P=0.000，圖2A、C)。

a.對照組；b.ALD組；c.Bufalin組；d.ALD+Bufalin組；e.ALD+CQ組；f.ALD+Bufalin+CQ組；*P<0.05vsa組；#P<0.05vsb組；△P<0.05vsc組；&P<0.05vsd組。

圖2自噬相關(guān)蛋白P62和LC3表達的變化

2.3各組大鼠系膜細胞凋亡的變化流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，a組細胞凋亡率(46.10±3.49)%，b組細胞凋亡率(76.47±3.03)%，c組細胞凋亡率(46.23±5.83)%；d組細胞凋亡率(61.73±2.76)%，e組細胞凋亡率(61.03±3.62)%，f組細胞凋亡率(60.50±1.95)%，各組細胞凋亡率存在顯著差異(F=95.55，P=0.000)，見圖3。c組與a組細胞凋亡率無顯著差異，b組細胞凋亡率較a組顯著升高(P=0.000)，d組、e組和f組細胞凋亡率無顯著差異，但與a組和c組比較均有明顯升高(P=0.000)，和b組比較顯著降低(P=0.000)。

a.對照組；b.ALD組；c.Bufalin組；d.ALD+Bufalin組；e.ALD+CQ組；f.ALD+Bufalin+CQ組；*P<0.05vsa組；#P<0.05vsb組；P<0.05vsc組。

圖3大鼠系膜細胞凋亡的變化

3討論

所有腎臟疾病均可能進展為慢性腎衰竭，進而嚴重影響人類生命長度及質(zhì)量，尋找新的延緩或阻止腎臟損害的治療方法十分重要。研究顯示醛固酮可能作為一個獨立的危險因素直接參與腎損害[5]。系膜細胞、內(nèi)皮細胞、足細胞等腎臟固有細胞的凋亡(又稱Ⅰ型程序性細胞死亡)在腎臟損害的發(fā)生發(fā)展中，扮演著至關(guān)重要的角色[6-9]，醛固酮被證實可誘導系膜細胞凋亡[1]，但其機制目前研究甚少。

自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是一個吞噬自身細胞質(zhì)或細胞器并使其包被進入囊泡,形成自噬體,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物的過程,藉此實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。在細胞饑餓、生長因子缺乏時，自噬對維持細胞的存活起到一定的積極作用，而過度的自噬可引起細胞死亡。自噬參與足細胞、腎小球內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞等腎臟固有細胞的損傷[9]，在急性和慢性腎臟疾病實驗模型中,自噬已被證明對腎細胞的存活至關(guān)重要[11]，干預腎疾病細胞的自噬,可能會阻止腎臟疾病的進展。自噬與凋亡間關(guān)系密切而復雜，某些情況下，細胞因應激誘導自噬增強，從而避免了凋亡；而另一些情況下，過度的自噬又可導致細胞的凋亡[12-13]，二者的動態(tài)平衡或失衡決定了細胞的生存或死亡，因此闡明自噬和凋亡的動態(tài)關(guān)系對細胞命運轉(zhuǎn)歸的作用機制具有重要意義,也有助于尋找治療腎臟疾病的有效措施。

在細胞自噬的研究中,用透射電子顯微鏡觀察細胞質(zhì)中雙層膜包裹所形成的自噬體是評估自噬的形態(tài)學金標準。LC3是一種自噬相關(guān)蛋白，在自噬體形成中起核心作用，胞漿可溶性LC3.Ⅰ在泛素樣修飾后,與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合,形成LC3.Ⅱ被募集到自噬前體上,形成自噬體,LC3.Ⅱ含量與自噬泡數(shù)量成正比,可用于判斷自噬水平的高低[14]。P62蛋白,通過LRS結(jié)構(gòu)域與LC3相互作用而定位在自噬體上,其C末端結(jié)構(gòu)域連接泛素化蛋白,并引導自噬體進行選擇性降解，當自噬功能障礙時,聚集在自噬體上的P62不能被降解,導致P62蛋白水平明顯增高[15]。因此,P62是評價自噬體降解的指標。本研究結(jié)果顯示ALD組可見典型自噬體，LC3、P62表達量及細胞凋亡率較對照組明顯升高；Bufalin組未見典型自噬體，LC3、P62表達量及細胞凋亡率與對照組基本相同，但較ALD組明顯下降；ALD+Bufalin組見自噬體較ALD組減少，LC3、P62表達量及細胞凋亡率較ALD組下降；ALD+CQ組見自噬體明顯多于ALD組，LC3、P62表達量較ALD組顯著升高，但細胞凋亡率較ALD組下降；ALD+ Bufalin+CQ組見自噬體多于ALD+Bufalin組，但少于ALD+CQ組，LC3、P62表達量及細胞凋亡率與ALD+CQ組基本相同。上述結(jié)果提示醛固酮可誘導系膜細胞自噬及凋亡，蟾蜍靈可抑制醛固酮誘導系膜細胞自噬及凋亡，自噬抑制氯喹通過組織自噬體與溶酶體結(jié)合抑制自噬，造成自噬體堆積，同時抑制凋亡。

綜上提示醛固酮可能誘導系膜細胞自噬促進細胞凋亡，這可能是引起的腎損傷的機制之一。因此本研究結(jié)果可以為醛固酮在腎損害的作用機制研究中提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)，并為醛固酮抑制劑、蟾蜍靈及氯喹治療相應腎臟疾病提供依據(jù)。

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Effects of autophagy on the apoptosis of mesenteric cells induced by aldosterone in rats with

invitrotechniqueQUGaoting,ZHANGAiqing,SHIHuimin,GANWeihua

Department of Pediatrics,The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210003,China

【Abstract】Objective： To investigate the potential mechanisms of renal injury associated with aldoserone(ALD) through observing the effects of autophagy on the apoptosis of mesenteric cells(MCs) induced by ALD and bufalin in rats with in vitro techniques.Methods:The mesenteric cells in rats were cultured with in vitro technique and induced with ALD,bufalin and chloroquine phosphate(CQ),respectively.Then rats were divided into groups of controls(group A),treated with ALD(10-6mol/L,group B),bufalin(10-8mol/L,group C),ALD+Bufalin(10-6mol/L +10-8mol/L,group D),ALD+CQ(10-6mol/L+10 μmol /L,group E) and ALD+Bufalin+CQ(10-6mol/L+10-8mol/L+10 μmol /L,group F).Transmission electron microscope was used to observe the autophagy in the mesenteric cells in each group of rats,and Western Blot was performed to determine the protein changes of P62 and LC3 suggestive of autophagy.Cellular apoptosis was detected with An-nexin V /PI flow cytometry.Results:Transmission electron microscopy showed no typical autophagosome in group A and C,yet prominent autophagosome in group B.Lower autophagosomes were seen in group D,whereas higher autophagosomes were found in group E and F.Western blotting revealed similar level of P62 and LC3 protein in group C to group A,yet higher level in group A than that of group A and C(P<0.05),lower level in group D than that of group B(P<0.05).Level of P62 and LC3 protein in group E was comparable to that of group F,yet the level was higher than remaining groups(P<0.05).Flow cytometry indicated the rate of cellular apoptosis of (46.23 ±5.83)% in group C and (46.10±3.49)% in group A.Although group B had higher incidence of apoptosis (76.47 ±3.03)% than group group A(P<0.05),yet it remained similar among groups of group D(61.73 ±2.76)%,group E(61.03 ±3.62)% and group F(60.50±1.95)%.However,apoptosis was higher in group A and C,and lower in group B (P<0.05).Conclusion:Aldosterone may induce autophagy as well as apoptosis of the mesenteric cells,and bufalin and chloroquine can inhibit the autophagy and apoptosis induced by ALD.

【Key words】aldosterone;bufalin;mesenteric cells;apoptosis;autophagy

【文獻標識碼】【中圖號】R 692A

作者簡介：曲高婷(1990-)，女，2014級碩士研究生，(電話)17701596663，(電子信箱)302936422@qq.com；

收稿日期：2015-08-22

文章編號：1002-0217(2016)02-0113-05

甘衛(wèi)華，女，主任醫(yī)師，(電子信箱)weihuagan@njmu.edu.cn，通訊作者.