公衍玲，劉　洋，王沙沙

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

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響應(yīng)面法優(yōu)化山櫻桃多酚提取工藝及其抗氧化活性研究

公衍玲，劉洋，王沙沙

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

摘要：對(duì)山櫻桃多酚的乙醇回流提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化并研究了其抗氧化活性。以多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用分光光度法測(cè)定吸光度，通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選得到山櫻桃多酚乙醇回流提取工藝的主要影響因素為液料比、乙醇濃度、回流時(shí)間；然后采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法確定最佳提取工藝為：液料比16∶1(mL∶g)、乙醇濃度68%、回流時(shí)間90 min、回流溫度90 ℃，在此條件下多酚得率預(yù)測(cè)值為1.172%，實(shí)測(cè)平均值為1.166%，RSD為0.55%；山櫻桃多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)羥基自由基及超氧陰離子自由基均有較強(qiáng)的清除作用。

關(guān)鍵詞：山櫻桃；多酚；提?。豁憫?yīng)面法；抗氧化活性

山櫻桃又名毛櫻桃，屬薔薇科李屬植物，落葉灌木，其果實(shí)為球形，性味甘溫，有調(diào)中、益脾之功效，可治療四肢癱瘓、風(fēng)濕腰疼等癥狀[1-3]。山櫻桃的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高，除含蛋白質(zhì)、碳水化合物外，還含有鈣、磷、鉀和多種維生素以及花青素、黃酮醇和酚酸等多酚類物質(zhì)[4-5]。研究表明，多酚具有較強(qiáng)的抗氧化[6-11]、清除自由基[12]、防治心腦血管疾病[13-15]和抗腫瘤等作用[16-17]。近年來，多酚類化合物憑借其良好的藥理作用受到研究者的廣泛關(guān)注，山櫻桃作為提取多酚類物質(zhì)的理想材料，具有良好的市場(chǎng)前景[18-21]。鑒于此，作者采用傳統(tǒng)乙醇回流法提取山櫻桃多酚，通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選主要影響因素；再通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并對(duì)山櫻桃多酚的抗氧化活性進(jìn)行研究，擬為山櫻桃的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料、試劑與儀器

山櫻桃，采自青島嶗山，經(jīng)青島科技大學(xué)化工學(xué)院中藥學(xué)副教授金宏老師鑒定為薔薇科植物山櫻桃的果實(shí)。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心；三氯乙酸，上海山浦化工有限公司；抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為市售分析純。

T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；6YP02N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2方法

1.2.1山櫻桃多酚的提取

精確稱取4.0g山櫻桃果肉，切塊，充分搗碎成粗漿，裝入蒸餾瓶。加入乙醇溶液，充分振搖后放入水浴鍋中充分冷凝回流提取，得粗提液。待粗提液冷卻后，用真空抽濾機(jī)減壓抽濾。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇，濃縮至一定體積作為提取液。

1.2.2山櫻桃多酚得率的測(cè)定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取干燥后的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg于5mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得1.0mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；精密量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL于10mL容量瓶中，加入5mL10%福林酚試劑，搖勻，靜置2～3min；再加入4mL7.5mg·mL-1Na2CO3溶液，搖勻，靜置60min，測(cè)定其在770nm處吸光度，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密量取提取液1.0mL，按上述方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中多酚質(zhì)量，按下式計(jì)算多酚得率：

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

1)液料比的選擇

固定回流溫度為90 ℃、回流時(shí)間為90 min、乙醇濃度為70%，在液料比(mL∶g，下同)分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的條件下提取山櫻桃多酚，測(cè)定多酚得率，選擇適宜液料比。

2)乙醇濃度的選擇

在確定液料比的情況下，在回流溫度為90 ℃、回流時(shí)間為90 min、乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的條件下提取山櫻桃多酚，測(cè)定多酚得率，選擇適宜乙醇濃度。

3)回流溫度的選擇

在確定液料比和乙醇濃度的情況下，在回流時(shí)間為90 min、回流溫度分別為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的條件下提取山櫻桃多酚，測(cè)定多酚得率，選擇適宜回流溫度。

4)回流時(shí)間的選擇

在確定液料比、乙醇濃度和回流溫度的情況下，在回流時(shí)間分別為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min的條件下提取山櫻桃多酚，測(cè)定多酚得率，選擇適宜回流時(shí)間。

1.2.4星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多酚得率為響應(yīng)值，進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化乙醇回流法提取山櫻桃多酚的工藝條件。

1.2.5山櫻桃多酚抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1抗氧化活性用山櫻桃多酚提取液的制備

在最優(yōu)工藝條件下提取山櫻桃多酚，分別配制成濃度為0.0625 g·mL-1、0.125 g·mL-1、0.25 g·mL-1、0.5 g·mL-1、1.0 g·mL-1的山櫻桃多酚提取液。

1.2.5.2清除羥基自由基活性測(cè)定

在具塞試管中依次加入9 mmol·L-1FeSO4溶液1 mL、9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1 mL、不同濃度的山櫻桃多酚提取液1 mL，再加入6 mmol·L-1H2O2溶液1 mL，開始反應(yīng)，并在37 ℃下水浴30 min后，測(cè)定510 nm處吸光度。每個(gè)具塞試管做3個(gè)平行，取平均值?？瞻讓?duì)照組以相同體積蒸餾水代替山櫻桃多酚提取液。

考慮到山櫻桃多酚提取液在510 nm處可能存在吸收，用相同體積的蒸餾水代替H2O2溶液，其余均相同，測(cè)定510 nm處吸光度。每個(gè)具塞試管做3個(gè)平行，取平均值。維生素C作為陽性對(duì)照。按下式計(jì)算清除率：

式中：A0為空白對(duì)照組的吸光度；Ax為加H2O2時(shí)山櫻桃多酚提取液的吸光度；Ax0為不加H2O2時(shí)山櫻桃多酚提取液的吸光度。

1.2.5.3清除超氧陰離子自由基活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22]，采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定山櫻桃多酚清除超氧陰離子自由基的活性。首先取0.05 mol·L-1pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液5 mL于具塞試管中，分別加入1 mL不同濃度的山櫻桃多酚提取液，25 ℃水浴20 min后，再加入3 mmol·L-1鄰苯三酚(于棕色瓶中現(xiàn)配)0.4 mL，搖勻，于25 ℃水浴反應(yīng)4 min后，立即用0.5 mL 10 mmol·L-1鹽酸終止反應(yīng)，測(cè)定320 nm處吸光度。每個(gè)具塞試管做3個(gè)平行，取平均值?？瞻讓?duì)照組以相同體積的Tris-HCl緩沖液代替山櫻桃多酚提取液。

考慮到山櫻桃多酚提取液在320 nm處可能存在吸收，用相同體積的Tris-HCl緩沖液代替鄰苯三酚溶液，其余均相同，測(cè)定320 nm處吸光度。每個(gè)具塞試管做3個(gè)平行，取平均值。維生素C作為陽性對(duì)照。按下式計(jì)算清除率：

2結(jié)果與討論

2.1山櫻桃多酚提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1液料比對(duì)多酚得率的影響(圖1)

圖1　液料比對(duì)多酚得率的影響

由圖1可以看出，在開始階段多酚得率隨著液料比的增大而升高；當(dāng)液料比為15∶1時(shí)，多酚得率達(dá)到最高；繼續(xù)增大液料比，多酚得率反而下降。這是因?yàn)椋跍囟纫欢ǖ臈l件下，物質(zhì)的溶解度是恒定的，因此多酚得率隨著液料比的增大而升高，但當(dāng)液料比增大到一定值時(shí)，多酚已基本溶出，此時(shí)增加溶劑對(duì)多酚得率影響不大。因此，選擇液料比15∶1為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.1.2乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響(圖2)

圖2　乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響

由圖2可以看出，多酚得率隨著乙醇濃度的增大先升高后降低，在乙醇濃度為70%時(shí)達(dá)到最高。根據(jù)相似相溶原理，與山櫻桃多酚極性相似的溶劑可以使其充分溶于溶劑中從而被提取出來。乙醇濃度過低，溶劑對(duì)氫鍵的破壞力不強(qiáng)，多酚得率不高；乙醇濃度過高，溶劑極性低，導(dǎo)致多酚得率下降。因此，選擇乙醇濃度70%為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.1.3回流溫度對(duì)多酚得率的影響(圖3)

圖3　回流溫度對(duì)多酚得率的影響

由圖3可以看出，多酚得率隨著回流溫度的升高呈先升高后降低趨勢(shì)，在回流溫度為90 ℃時(shí)，多酚得率達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，回流溫度越高，溶劑分子運(yùn)動(dòng)越快，促進(jìn)了多酚的溶解，多酚得率相應(yīng)升高；回流溫度過高，對(duì)多酚造成了破壞，導(dǎo)致多酚得率降低。因此，選擇回流溫度90 ℃為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.1.4回流時(shí)間對(duì)多酚得率的影響(圖4)

由圖4可以看出，多酚得率隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，在回流時(shí)間為90 min時(shí)多酚得率達(dá)到最高。這可能是由于，長(zhǎng)時(shí)間的提取破壞了多酚類化合物的酚羥基結(jié)構(gòu)[23]，導(dǎo)致其得率下降；且長(zhǎng)時(shí)間浸泡可能造成乙醇和多酚發(fā)生反應(yīng)，降低了提取液中多酚含量，導(dǎo)致多酚得率下降。因此，選擇回流時(shí)間90 min為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

圖4　回流時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

2.2山櫻桃多酚提取的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

2.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

考慮到回流溫度的趨勢(shì)線較為平緩，對(duì)多酚得率的影響不大，所以固定回流溫度與回流次數(shù)，選擇液料比、乙醇濃度、回流時(shí)間為考察因素，以多酚得率為響應(yīng)值進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素與水平

Tab.1

Factors and levels of central composite

2.2.2模型方程

以多酚得率為因變量，采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)各因素進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到以山櫻桃多酚得率(Y)為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：Y=-1.48738+0.087354A+0.020166B+0.059747C-0.00236881A2+0.000164022AB-0.000176101B2-0.0000902098AC+0.000021738BC-0.000032859C2，R2=0.9421。方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，模型的P值小于0.0001，說明二次方程具有高度顯著性，模型與實(shí)驗(yàn)實(shí)際擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，較好地反映了山櫻桃多酚得率與液料比、乙醇濃度、回流時(shí)間的關(guān)系。一次項(xiàng)中液料比、乙醇濃度、回流時(shí)間對(duì)多酚得率的影響極顯著(P<0.01)，二次項(xiàng)中除液料比與回流時(shí)間的交互作用不顯著外(P>0.05)，其它作用均顯著。刪除不顯著項(xiàng)可得簡(jiǎn)化方程：Y=-1.48738+0.087354A+0.020166B+0.059747C-0.00236881A2+0.000164022AB-0.000176101B2+0.000021738BC-0.000032859C2。

表2

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Tab.2

Design and results of central composite

表3

擬合二次方程的方差分析結(jié)果

Tab.3

Results of variance analysis of quadratic model

注：*表示P<0.05，有顯著意義；**表示P<0.01，有極顯著意義。

2.2.3響應(yīng)面分析及工藝優(yōu)化

采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析2個(gè)自變量的交互作用對(duì)山櫻桃多酚得率的三維響應(yīng)面圖，如圖5所示。

圖5　乙醇濃度和液料比(a)、回流時(shí)間和液料比(b)、回流時(shí)間和乙醇濃度(c)的交互作用對(duì)山櫻桃多酚得率的響應(yīng)面分析

由圖5可以看出，液料比在9.05∶1～20.95∶1范圍內(nèi)、乙醇濃度在58.11%～81.89%范圍內(nèi)、回流時(shí)間在72.16～107.84 min范圍內(nèi)有較高的多酚得率。經(jīng)分析得到回歸模型的最大值點(diǎn)分別為液料比16.02∶1、乙醇濃度68.64%、回流時(shí)間90.31 min，此條件下多酚得率可達(dá)1.172%。

結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定山櫻桃多酚的最優(yōu)提取工藝條件為：液料比16∶1、乙醇濃度68%、回流時(shí)間90 min、回流溫度90 ℃。

2.2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)條件下，即液料比16∶1(mL∶g)、乙醇濃度68%、回流時(shí)間90 min、回流溫度90 ℃，采用乙醇回流法提取山櫻桃多酚，重復(fù)提取3次，計(jì)算多酚得率并與預(yù)測(cè)值比較，結(jié)果見表4。

表4

多酚得率實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值的比較/%

Tab.4Comparison of measured value with predicted value/%

實(shí)驗(yàn)號(hào)實(shí)測(cè)值預(yù)測(cè)值偏差率平均偏差率RSD11.1630.7721.1511.1721.791.170.5531.1830.94

由表4可知，平均偏差率為1.17%，RSD為0.55%?？梢姡蓴?shù)學(xué)模型所得到的較優(yōu)條件與設(shè)計(jì)目標(biāo)相符，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)模型具有可靠性和重現(xiàn)性。

2.3山櫻桃多酚的抗氧化活性測(cè)定

2.3.1對(duì)羥基自由基的清除作用

不同濃度的山櫻桃多酚提取液和維生素C對(duì)羥基自由基的清除作用如圖6所示。

Ⅰ～Ⅴ：山櫻桃多酚提取液濃度(g·mL-1)，0.0625、0.125、

由圖6可以看出，隨著山櫻桃多酚提取液濃度的增大，羥基自由基清除率逐漸升高；當(dāng)山櫻桃多酚提取液濃度在1.0 g·mL-1時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)92.61%，與維生素C的羥基自由基清除率相當(dāng)。

2.3.2對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

不同濃度的山櫻桃多酚提取液和維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用如圖7所示。

由圖7可以看出，山櫻桃多酚提取液對(duì)超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，且隨著山櫻桃多酚提取液濃度的增大，超氧陰離子自由基清除率相應(yīng)升高；當(dāng)山櫻桃多酚提取液濃度為1.0 g·mL-1時(shí)，超氧陰離子自由基清除率可達(dá)84.27%，與維生素C的抗氧化活性接近，說明山櫻桃多酚提取液具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

Ⅰ～Ⅴ：山櫻桃多酚提取液濃度(g·mL-1)，0.0625、0.125、

3結(jié)論

采用乙醇回流法提取山櫻桃多酚，通過單因素實(shí)驗(yàn)和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝為：液料比16∶1(mL∶g)、乙醇濃度68%、回流時(shí)間90 min、回流溫度90 ℃，在此條件下，山櫻桃多酚得率的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近，表明由星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)所得到的較優(yōu)條件與設(shè)計(jì)目標(biāo)相符，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)模型具有可靠性和重現(xiàn)性，最優(yōu)條件可用于山櫻桃多酚的提取。山櫻桃多酚提取液對(duì)羥基自由基及超氧陰離子自由基均有明顯的清除作用，表明山櫻桃多酚提取物可作為理想的自由基清除劑和天然抗氧化劑，應(yīng)用潛力無限。

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Optimization of Extraction Process for Polyphenols fromCerasusTomentosaWall.by Response Surface Methodology and Study on Its Antioxidant Activity

GONG Yan-ling,LIU Yang,WANG Sha-sha

(CollegeofChemicalEngineering,QingdaoUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266042,China)

Abstract：The extraction process of polyphenols from Cerasus tomentosa Wall. was optimized and its antioxidant activity was studied.Using the yield of polyphenols as an evaluation index,through determining the absorbance by spectrophotometry,the main influencing factors of ethanol refluxing extraction process for polyphenols from Cerasus tomentosa Wall.,including liquid-solid ratio,ethanol concentration,refluxing time were selected.Through a central composite design-response surface methodology,the optimum extraction conditions were obtained as follows：liquid-solid ratio of 16∶1(mL∶g),ethanol concentration of 68%,refluxing time of 90 min,and refluxing temperature of 90 ℃.Under above conditions,the yield of polyphenols was predicted to be 1.172%,measured average value was 1.166%,RSD was 0.55%.Under the optimum conditions,the polyphenols from Cerasus tomentosa Wall. exhibited a high antioxidant activity with obvious scavenging effect on hydroxyl free radicals and superoxide anion free radicals.

Keywords：Cerasus tomentosa Wall.;polyphenol;extraction;response surface methodology;antioxidant activity

中圖分類號(hào)：R 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)04-0012-06

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.004

作者簡(jiǎn)介：公衍玲(1975-)，女，山東人，博士，副教授，研究方向：藥物活性篩選和藥效學(xué)，E-mail：hanyu_ma@126.com。

收稿日期：2015-12-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(81300281)，山東省高?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J15LK12)