王萍，司雄元，檀華蓉*，徐慧敏

1(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥，230036) 2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)中心，安徽 合肥，230036)

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6-氨基青霉素烷酸分子印跡固相萃取柱在牛乳青霉素藥物檢測中的應(yīng)用

王萍1，司雄元2，檀華蓉2*，徐慧敏1

1(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥，230036) 2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)中心，安徽 合肥，230036)

摘要用實驗室制備的分子印跡固相萃取柱完成市售牛乳樣品中青霉素類藥物的提取分離。以青霉素中間體6-氨基青霉烷酸(6-Aminopenicillanic acid，6-APA)為虛擬模板分子，甲酸作為致孔劑，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，合成6-APA分子印跡聚合物(molecular imprinted polymers，MIPs)，并對制備條件進行了優(yōu)化，確定最佳的制備條件是模板分子∶功能單體∶交聯(lián)劑(摩爾比)=1∶5∶30。采用選擇性吸附試驗比較青霉素類藥物與恩諾沙星在該MIPs的吸附情況，結(jié)果表明:MIPs對青霉素類藥物及其中間體具有特異性吸附；通過紅外光譜和掃描電鏡對MIPs結(jié)構(gòu)和形貌進行表征，紅外光譜分析可知，MIPs內(nèi)部具有鍵合氫鍵的位點，觀察MIPs掃描電鏡圖發(fā)現(xiàn)MIPs表面具有大量孔穴。使用該MIPs裝填的固相萃取柱對牛乳樣品進行預(yù)處理，并采用高效液相色譜進行檢測，結(jié)果顯示有牛乳樣品中含有較高濃度6-APA；用空白樣品添加不同濃度水平的3種青霉素類藥物及6-APA混合溶液進行加標回收率實驗，加標回收率為83.5%～87.3%，相對標準偏差(RSDs)為1.03%～7.35%。6-APA分子印跡固相萃取柱在復(fù)雜基質(zhì)如動物源食品、水體、土壤樣品的檢測中具有廣闊前景。

關(guān)鍵詞中間體；虛擬模板；分子印跡固相萃取；青霉素類藥物；牛乳

青霉素類抗生素(penicillins，PENs)是含有6-氨基青霉烷酸(6-APA)母核結(jié)構(gòu)的一類廣譜抗生素[1-2]，在畜牧業(yè)上廣泛用于家畜的呼吸道感染、腸胃道感染等疾病的治療和預(yù)防[3]，是治療奶牛乳腺炎的首選藥物。禽畜養(yǎng)殖過程中不規(guī)范使用抗生素會造成動物源食品中的藥物殘留、進入動物體內(nèi)的殘留藥物通過尿液、排泄物進一步污染水體及土壤[4-6]。美國FDA、歐盟及我國農(nóng)業(yè)部對青霉素類藥物最高殘留量有做明確規(guī)定，因此確定準確、高效、靈敏度高的檢測方法行之必要。目前對PENs進行檢測的手段主要有微生物測定法、高效液相色譜法及LC-MS/MS[7-8]檢測法。

食品基質(zhì)中的青霉素藥物殘留往往處于痕量級，背景干擾復(fù)雜，為保障檢測結(jié)果的準確性需要選擇有效的前處理技術(shù)。前處理不當(dāng)，不僅帶來基質(zhì)干擾，甚至影響儀器使用壽命[9]。分子印跡固相萃取(molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE)是將具有專一性、高度選擇性的的分子印跡聚合物(MIPs)作為萃取填料，能夠選擇性濃縮痕量待測物，進而提高分離效率和分析準確性。MISPE在固相萃取領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，已有報道MISPE成功應(yīng)用于磺胺類藥物殘留[10]、血清鄰苯二甲酸酯殘留的檢測分析[11]。

本研究將所合成的對具有6-APA母核的青霉素類抗生素均有良好的識別性能的MIPs用作固相萃取填料，提高實驗分析效率。用6-APA分子印跡聚合物裝填的固相萃取柱成功應(yīng)用于市售牛乳的預(yù)處理，具有一定的實際應(yīng)用價值。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

6-氨基青霉烷酸(6-Aminopenicillanic acid，6-APA)、青霉素鉀(penicillin G，PEN)、阿莫西林(amoxicillin，AMO)、氨芐青霉素(ampicillin，AMP)、恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)均由武漢遠成科技有限公司提供(純度99%)；甲酸、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、三氯甲烷、溴化四丁基銨、磷酸二氫鉀和硼砂、甲基丙烯酸(methacrylic acid，MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA)均購自國藥集團，分析純；偶氮二異丁腈(2，2-azobisisobutyronitrile，AIBN)，化學(xué)純，使用前用甲醇重結(jié)晶；甲醇、乙腈，色譜純；超純水。

氮吹儀HGC-24A，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；紫外分光光度計UV-2501PC，日本島津公司；高效液相色譜儀(配有Waters 600四元泵系統(tǒng)、Waters 2998紫外檢測器和Waters 2707自動進樣器，美國Waters)；P/ACETMMDQ高效毛細管電泳儀(配有二極管陣列檢測器、未涂層熔融石英毛細管60 cm×50 μm和色譜工作站，美國Beckman)；S-4800掃描電子顯微鏡，日本Hitachi；Nicolette is50傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Scientific。

1.2實驗方法

1.2.16-APA MIPs的制備條件優(yōu)化

精確稱取一定量模板分子6-APA于30.0 mL的螺口試管中，加入10.0 mL溶劑溶解，加入一定量功能單體MAA，超聲振蕩30 min，再加入一定量交聯(lián)劑EGDMA和引發(fā)劑AIBN于室溫下超聲振蕩15 min，充氮除氧后密封，置60 ℃水浴中加熱24 h制備印跡聚合物。將所得的白色聚合物研磨粉碎，同時過200目和250目篩，得到200～250之間目數(shù)的粉末，備用。用體積比7∶3的乙腈-水溶液洗脫聚合物中的模板分子，再依次用乙腈、去離子水洗脫至中性。收集產(chǎn)物于烘箱60 ℃干燥，得到以6-APA為虛擬模板的分子印跡聚合物(MIPs)。

1.2.2選擇性實驗

準確稱取5份等量20.0 mg分子印跡聚合物放入5個規(guī)格相同的5.0 mL離心管中，分別加入2.0 mL濃度為1 mmol/L的同類藥物6-APA、AMP、AMO、PEN的水溶液和不同類藥物恩諾沙星(ENR)的水溶液，置于恒溫搖床中室溫下振蕩2 h，然后將該混合液離心5 min，取1.0 mL的上清液，用高效毛細管電泳法(high performance capillary electrophoresis，HPCE)測定吸附平衡時溶液中游離底物的濃度，測定3次，取平均值，根據(jù)結(jié)合前后溶液濃度的變化，計算MIPs與底物的靜態(tài)吸附分配系數(shù)KD。

1.2.3光譜實驗和掃描電鏡分析

稱取一定量的MIPs和NMIPs粉末，用傅立葉紅外光譜儀測其紅外光譜，以純的KBr為底樣測試，在波數(shù)范圍4 000～400 cm-1測定，光譜分辨率優(yōu)于0.09 cm-1，掃描速度：0.158～6.28 cm/s。觀察聚合物是否存在可以鍵合氫鍵的作用點。

采用S-4800掃描電子顯微鏡分別觀察MIPs和NMIPs粉末的形貌粒徑，測試時樣品溶解在無水乙醇中，待無水乙醇揮發(fā)后，進行電鏡測定，采用高真空模式，調(diào)整加速電壓為5 kV，分辯率達到1.0～1.4 nm。觀察粉末的孔穴分布和粒徑大小。

1.2.4MISPE小柱的制備及應(yīng)用

稱取150.0 mg MIPs及75.0 mg硅藻土(MIPs∶硅藻土質(zhì)量比=2∶1)裝入3.0 mL空的固相萃取(SPE)柱中，用篩板壓緊，輕敲小柱，直至篩板與聚合物結(jié)合緊密為止。6-APA MISPE柱先用2.0 mL甲醇活化；再加入5.0 mL正己烷，待正己烷沒入柱填料時，取待測樣品溶液，以5.0 mL/min的流速過柱；用5.0 mL正己烷淋洗，棄淋洗液；再用6.0 mL甲醇-乙酸(體積比為8∶2)溶液進行洗脫；收集洗脫液，用氮吹儀吹干，復(fù)用超純水溶解，過0.22 μm的微孔濾膜，供HPLC檢測。

1.2.5牛乳樣品及處理方法

于合肥超市隨機購買不同品牌不同批次的牛乳樣品。準確量取10.0 mL同一牛乳樣品2份，分別采用10.0 mL溴化四丁基銨乙腈溶液提取，漩渦振蕩10 min，高速離心后分離上清液。下層殘渣再重復(fù)提取兩次，合并3次上清提取液，提取液用乙腈除蛋白，正己烷振蕩萃取去除脂質(zhì)。水相于50 ℃水浴蒸干后，再用0.5 mol/L KH2PO4溶液使之充分溶解。

將上述處理后的樣品分別用制備的6-APA MISPE小柱按照1.2.4凈化，待測。

1.2.6高效液相色譜條件

色譜柱：Xterra?MS C18柱(4.6 mm×250 mm)；流動相：V(乙腈)∶V(水)=5∶95等度洗脫，流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量：10 μL。紫外檢測器：檢測波長210 nm。

2結(jié)果與討論

2.1MIPs的制備與優(yōu)化

考察甲酸、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺等不同的溶劑體系對6-APA的溶解效果。實驗結(jié)果表明，6-APA不溶于多數(shù)有機溶劑，微溶于水，易溶于甲酸，且遇堿易分解，因此選擇甲酸作為致孔劑。

功能單體(MAA)用量對MIPs的合成有顯著影響，添加量不足聚合不充分，添加量過高會自締合形成非特異性結(jié)合位點；交聯(lián)劑(EGDMA)使得聚合物具有剛性的網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)。考察模板分子、功能單體及交聯(lián)劑不同的比例合成的MIPs的吸附容量差異，實驗結(jié)果表明，當(dāng)6-APA∶MAA∶EGDMA=1∶5∶30時效果最佳。非印跡聚合物(NMIPs)的制備過程除不加模板分子，其他步驟與MIPs制備相同。

2.2聚合物的特異吸附性

為考察MIPs對青霉素類藥物的吸附特異性，采用靜態(tài)吸附分配系數(shù)KD來表示MIPs對底物的選擇性[12]。KD=cs/cB，其中cs(μmol/mL)表示待測底物的起始濃度，cB(μmol/mL )表示吸附平衡后剩余底物在溶液中的濃度，計算結(jié)果見表1。

表1　平衡結(jié)合條件下MIPs與結(jié)合底物的KD值

由表1可見MIPs對于6-APA的KD值明顯大于其他藥物，其他3種青霉素類藥物結(jié)構(gòu)與6-APA越接近，KD值也就越大，說明以6-APA為模板分子合成的MIPs洗脫后所留下立體孔穴的結(jié)構(gòu)形狀能與6-APA相匹配，具有一定的識別能力；同時，MIPs對于PENs具有較高吸附容量，結(jié)合量明顯高于ENR，這是由于ENR的結(jié)構(gòu)與MIP中的立體孔穴相差較大，難以進入孔穴內(nèi)部與識別位點發(fā)生作用。上述實驗結(jié)果表明，制備的MIPs對PENs的吸附具有特異性。

2.3聚合物的光譜分析分析與形貌表征

2.3.1紅外光譜分析

非印跡聚合物NMIPs和印跡聚合物MIPs的紅外光譜結(jié)果如圖1。

圖1　NMIPs(a)和MIPs(b)的紅外光譜圖Fig.1　FTIR spectrum of NMIPs (a) and MIPs (b)

2.3.2掃描電鏡分析

非印跡聚合物NMIPs和印跡聚合物MIPs的掃描電鏡結(jié)果如圖2。

圖2　NMIPs(a)和MIPs(b)的SEM圖Fig.2　SEM micrographs of NMIPs(a) and MIPs(b)

由圖2(a)和圖2(b)可見，NMIPs 微球表面光滑，平均粒徑約為1.5 ～2 μm，分布較為均勻；而MIPs 微球表面粗糙，粒徑分布較寬，粗糙的微球表面具有大量的一定孔徑的孔穴，因此具有較大的比表面積和孔體積，有利于底物和結(jié)合位點的接觸，從而有高的負載量和對底物的高識別性。

2.4市售牛奶樣品檢測

取6個不同品牌的牛奶樣品，每個品牌選取3個批次進行檢測，分別編號1-1，1-2，1-3,……,6-3。按照1.2.4和1.2.5提取、凈化牛奶樣品，用HPLC檢測，檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示其中2個品牌各有一個批次檢出含有AMO，含量分別為0.04 mg/L和0.02 mg/L，符合《動物性食品中獸藥最高殘留限量》相關(guān)規(guī)定；某品牌有1個批次的牛乳樣品檢測出含有6-APA，根據(jù)標準曲線定量確定含量分別0.16 mg/L, 液相色譜圖見圖3；其他品牌牛乳樣品6-APA和原藥均未檢出。6-APA作為青霉素藥物中間體，抗菌能力弱，一般不直接應(yīng)用于禽畜養(yǎng)殖生產(chǎn)中。樣品中未檢測到青霉素原藥，而只檢測出6-APA，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是在牛乳中添加了β內(nèi)酰胺酶或青霉素?；?，這2種酶可以催化青霉素類藥物水解成中間體6-APA[13]，可進一步通過微生物法對可疑樣品中的β內(nèi)酰胺酶進行檢測確定[14-15]。

表2　牛奶樣品的檢測結(jié)果　單位：mg/L

注：ND未檢測出。

a-樣品編號No.2-3； b-樣品編號No.4-2； c-樣品編號No.6-1圖3　牛奶樣品的HPLC圖Fig.3　Chromatography of milk samples

2.5加標回收率實驗

實驗中以0.6、1.2和2.5 mg/L 3個質(zhì)量濃度水平向空白牛乳樣品中添加青霉素類(PENs)混合標準液，按照1.2.5處理樣品，每個濃度水平平行測定6次，根據(jù)HPLC工作曲線進行定量，計算加標回收率，色譜圖見圖4。實驗結(jié)果見表3，4種青霉素類(PENs)藥物的平均回收率為83.5%～87.3%，相對標準偏差(RSDs)為1.03%～7.35%；根據(jù)S/N=3，計算出方法檢出限(limit of detection，LOD)為8.24 ug/L。

a-加標水平0.6 mg/mL； b-加標水平1.2 mg/mL；c-加標水平2.5 mg/mL圖4　加標牛奶樣品的液相色譜圖Fig.4　Chromatography of a milk sample spiked with PENs at different level

名稱添加水平/(mg·L-1)回收率/%相對標準偏差/%6-APA2.587.31.031.287.12.460.686.95.79AMO2.587.11.781.286.62.270.686.07.35AMP2.586.71.661.286.56.900.686.34.05PEN2.584.91.211.284.74.190.683.53.92

3結(jié)論

以6-APA為虛擬模板，采用本體聚合法，優(yōu)化了致孔劑類型、功能單體及交聯(lián)劑用量、洗脫劑體系，制備出對青霉素類藥物具有選擇吸附性和較大吸附容量的分子印跡聚合物。

利用該6-APA分子印跡聚合物制作的固相萃取小柱對牛乳樣品進行預(yù)處理，采用HPLC法對6種市售牛乳中的青霉素藥物進行檢測，發(fā)現(xiàn)部分牛乳樣品中AMO有檢出，品牌2牛乳樣品中有一個批次檢測出較高濃度的6-APA。加標回收率實驗表明，4種青霉素類藥物的回收率均高于80%，滿足檢測要求；方法檢出限(LOD)為8.24 μg/L，符合檢測標準。針對市售牛乳制品中可能存在加入β內(nèi)酰胺酶或青霉素?；?，將青霉素類藥物水解成較穩(wěn)定的中間體6-APA的現(xiàn)象，市場監(jiān)察部門在牛乳青霉素類抗生素的檢測中，應(yīng)加強對中間體6-APA的監(jiān)控。

參考文獻

[1]VALENCIA P，F(xiàn)LORES S，WILSON L，et al. Effect of internal diffusional restrictions on the hydrolysis of penicillin G: reactor performance and specific productivity of 6-APA with immobilized penicillin acylase[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，165(2)：426-441.

[2]MARTINEZ-HERNANDEZ J L，MATA-GOMEZ M A，AGUILAR-GONZALEZ C N，et al. A process to produce penicillin G acylase by surface-adhesion fermentation using mucor griseocyanus to obtain 6-aminopenicillanic acid by penicillin G hydrolysis[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，160(7)：2 045-2 053.

[3]黃百芬，任一平，蔡增軒. LC-MS/MS測定牛奶中六種青霉素類抗生素殘留[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2007，19(1)：31-35.

[4]SUSAN S，MOSLEM J. Solid-phase extraction of florfenicol from meat samples by a newly synthesized surface molecularly imprinted sol-gel polymer[J].Food Anal. Methods，2014，7(10)：2 084-2 094.

[5]WANG Xiu-pin，LI Pei-wu. Rapid screening of mycotoxins in liquid milk and milk powder by automated size-exclusion SPE-UPLC-MS/MS and quantification of matrix effects over the whole chromatographic run[J]. Food Chemistry，2015，173：897-904.

[6]李清雪，劉巨波，劉 娟. 水環(huán)境中多種磺胺類抗生素殘留的HPLC同步檢測[J].河北師范大學(xué)學(xué)報，2013，37(3)：270-275.

[7]CHEN Jia-bin，ZHOU Xue-fei，ZHANG Ya-lei，et al. Potential toxicity of sulfanilamide antibiotic:binding of sulfamethazine to human serum albumin[J].Science of the Total Environment，2012，432(16)：269-274.

[8]劉創(chuàng)基，王海，杜振霞，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛肉中青霉素類藥物及其代謝產(chǎn)物[J].分析化學(xué)研究報告，2011，39(5)：617-622.

[9]祝曙華，蘇青云.四種固相萃取柱在豬肉四種氟喹諾酮類藥物殘留檢測中的應(yīng)用比較[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2014，5(2)：416-420.

[10]杜碧柏，許 楊，黃運紅，等.分子印跡固相萃取一高效液相色譜法測定飼料中磺胺類藥物[J].分析化學(xué)研究報告，2012，40(12)：1 871-1 876.

[11]賴家平，孫 慧，陳芳，等.分子印跡微米微球的合成方法及在固相萃取中的應(yīng)用研究進展[J].分析測試學(xué)報，2012，31(9)：1 161-1 169.

[12]尹雅楠，胡小玲，管 萍，等. 雙甘氨肽分子印跡聚合物微球的吸附性能研究[J].化學(xué)通報，2012，75(1)：58-62.

[13]田春秋，檀華蓉，高麗萍，等.高效毛細管電泳法檢測牛奶中的青霉素中間體以及3種青霉素類藥物[J].色譜，2011，29(11)：1 128-1 132.

[14]孟靜，王 銳，祝建華. 生鮮牛乳中抗生素檢測方法的新問題[J]. 中國乳品工業(yè)，2010，38(9)：42-44.

[15]崔生輝，李景云，馬 越，等.“生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志，2007，19(2)：113-116.

[16]檀華蓉，司雄元，田春秋，等.一種青霉素類抗生素及其中間體的分子印跡聚合物的制備方法與應(yīng)用：中國，201210475719.1[P].2014-03-26.

Application of 6-APA molecular imprinted solid-phase extraction column in the detection of penicillins in milk

WANG Ping1， SI Xiong-yuan2, TAN Hua-rong2*， XU Hui-min1

1(College of Tea&Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China) 2(Biotechnology Center，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)

ABSTRACTThe homemade 6-APA molecular imprinted solid-phase extraction (MISPE) column was applied in the extraction and separation of penicillins in market milk, largely enhancing the analytical speed. The molecularly imprinted polymers (MIPs) was prepared using 6-aminopenicillanic acid which is the intermediate of penicillins as the virtual template, methylacrylic acid as the functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate as the cross-linking monomer. The structure and morphology of molecularly imprinted polymers were characterized by Fourier Transform infrared spectroscopy (FTIR) and Scanning Electron Microscope (SEM). The result of FTIR showed that there was hydrogen bonding sites inside of MIPs. The result of SEM indicated that there were large amounts of holes on the surface of MIPs. The selective adsorption ability of MIPs was detected by specific adsorption experiment, and it illustrated that the MIPs had selectivity for Penicillin drugs. The solid phase extraction (SPE) column packed with MIPs was used for pretreatment of milk sample, coupled with HPLC detection. The results came out that one sample contained high content of 6-APA, without other three PENs. The recovery experiment was conducted at 3 different spiked levels, and the results showed the recovery rate was 83.5%～87.3%. The 6-APA MISPE column also has broad prospects in the detection of complex matrices like animal food, water samples and soil samples.

Key wordsintermediate； virtual template； molecularly imprinted solid-phase extraction； Penicillin antibiotic； milk

收稿日期：2015-08-20，改回日期：2015-10-19

基金項目：安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)重點研究項目(No.KT2013A114)；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)2014學(xué)科骨干培訓(xùn)項目(No.2014XKPY-66)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604033

第一作者：碩士研究生(檀華蓉副研究員為通訊作者，E-mail：tan890112@ahau.edu.cn)。