宋健文， 張景華， 宋建駟(西安市兒童醫(yī)院皮膚科，西安　7000; 西安市兒童醫(yī)院預(yù)檢科; 陜西科技大學(xué)體育部; 通訊作者，E-mail: jian-ssong@6.com)

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miRNA-17對UVA誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞光老化的調(diào)節(jié)作用

宋健文1， 張景華2， 宋建駟3*(1西安市兒童醫(yī)院皮膚科，西安710003;2西安市兒童醫(yī)院預(yù)檢科;3陜西科技大學(xué)體育部;*通訊作者，E-mail: jian-ssong@126.com)

摘要：目的檢測miR-17在長波紫外線(UVA)誘導(dǎo)的光老化中的調(diào)節(jié)作用。方法分離人皮膚成纖維細(xì)胞(HDFs)，用0 J/cm2(對照組),2.5,5.0，7.5 J/cm2劑量的UVA輻射誘導(dǎo)光老化模型，用實時定量PCR和Western blot分別檢測miR-17和基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)的表達(dá)水平。對HDFs細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-17的功能模擬物、miR-17陰性對照物、miR-17的功能抑制物和miR對照的功能抑制物，轉(zhuǎn)染24 h后UVA輻射誘導(dǎo)光老化模型，檢測MMP3蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果經(jīng)不同劑量UVA輻射后，HDFs中MMP3表達(dá)與對照組相比顯著升高(P<0.01)，且miR-17表達(dá)與對照組相比顯著降低(P<0.01)，其中2.5 J/cm2組的MMP3蛋白表達(dá)水平和miR-17表達(dá)顯著低于5.0 J/cm2組和7.5 J/cm2組(P<0.05)。miR-17轉(zhuǎn)染HDFs后再用UVA輻射，miR-17轉(zhuǎn)染組的MMP3的蛋白水平顯著低于miR對照組(P<0.05)，而miR-17抑制物轉(zhuǎn)染組MMP3的蛋白水平與miR對照組相比無顯著的改變。 結(jié)論人皮膚成纖維細(xì)胞光老化模型中UVA可導(dǎo)致miR-17表達(dá)的下降，從而負(fù)性調(diào)節(jié)MMP3的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：光老化；人皮膚成纖維細(xì)胞；長波紫外線；miR-17；基質(zhì)金屬蛋白酶-3

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長20-22核苷酸的小的非編碼RNA，它們可與靶基因的mRNA 3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或阻斷mRNA翻譯[1,2]。目前已經(jīng)清楚知道m(xù)iRNA通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)參與細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、代謝、凋亡等多種生理活動的調(diào)節(jié)[3]。因此，研究miRNA在特定病理過程中的作用可為該疾病臨床預(yù)防和治療提供重要思路。

皮膚的光老化是指長波紫外線(ultraviolet A，UVA)照射引起的皮膚松弛、皺紋增多且粗大、皮膚增厚、粗糙、色素沉著、毛細(xì)血管擴(kuò)張等改變[4]。皮膚的光老化不僅有損人的容顏，更重要的是與皮膚癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此闡明光老化的病理生理機(jī)制，尋找更有效的預(yù)防與治療措施受到越來越多的關(guān)注。

光老化主要由于日光中的長波紫外線引發(fā)的真皮結(jié)締組織中膠原纖維的斷裂和無序排列，以及異常彈性物質(zhì)的堆積。多種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)參與了皮膚光老化過程，其中長波紫外線可誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞中MMP3的表達(dá)進(jìn)而參與光老化過程[5]。研究光老化過程中MMP3表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，對于深入理解光老化的分子病理機(jī)制具有重要意義。

有研究表明MMP3的表達(dá)可在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，而miRNA發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[6,7]。根據(jù)Lin等報道，miR-17可調(diào)節(jié)MMP3的表達(dá)[8]。本研究探討了紫外線誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞光老化模型中MMP3和miR-17的表達(dá)水平及兩者之間的相互關(guān)系。

1材料及方法

1.1細(xì)胞株、試劑及儀器

人皮膚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)：取成年男性的包皮組織，用含有青霉素100 U/ml、鏈霉素100 pg/ml的PBS 漂洗3次后，剪去皮下脂肪組織，并將皮膚組織剪成0.5 mm的組織塊，用5 mg/ml膠原酶在37 ℃消化4 h，在1 000 r/min離心獲得細(xì)胞沉淀，用含10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，在37 ℃，5%CO2無菌培養(yǎng)[9]。第3-6代細(xì)胞用于實驗。

1.2紫外線照射細(xì)胞

按照5.0×105細(xì)胞/孔的密度把人皮膚成纖維細(xì)胞(HDFs)接種于6孔板中。在細(xì)胞融合度達(dá)80%-90%時，棄去培養(yǎng)基，用UV 181 AL unit水平臺(Villingen-Schwenningen公司，德國)上進(jìn)行紫外線照射。輻射波長320-400 nm，峰值在365 nm。共設(shè)4個組：對照組(0 J/cm2)、2.5 J/cm2、5.0 J/cm2和7.5 J/cm2組。四組的細(xì)胞接受照射劑量為0,2.5,5,7.5 J/cm2。照射后立即加入10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。收集細(xì)胞樣本用于后續(xù)實驗。對照組沒有受到紫外照射。

1.3MMP3和miR-17 RNA水平的檢測

用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，在核酸蛋白定量儀上測定RNA樣品的濃度。取2 μg總RNA，用MBI的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。運(yùn)用stem-loop RT-PCR法反轉(zhuǎn)miRNAs。hsa-miR-17序列號為：AF480529.1，stem-loop引物序列如下：Has-miR-17 stem-loop：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC-GCACTGGATACGACACCTACAAGTGCC。實時定量PCR檢測MMP3和miR-17的表達(dá)，反應(yīng)體系為10 μl，引物濃度為10 pmol/μl。擴(kuò)增條件：94 ℃ 變性30 s，58 ℃退火30 s ,72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，用sybergreen染料定量。PCR所需的引物序列見表1。

表1MMP3、miR-17及內(nèi)參引物序列

Table 1The primers of MMP3, miR-17 and internal control primer

基因 序列 產(chǎn)物大小(bp)MMP3F5'-TTGGCCCATGCCTATGCCCC-3'156R5'-ACAGGCGGAACCGAGTCAGG-3'miR-17F5'-CAGTAAAGGTAAGGAGAGCTCAATCTG-3'R5'-CATACAACCACTAAGCTAAAGAATAATCTGA-3'U6F5'-CGCCTCAGCCTGTTGTTCTTC-3'R5'-CCGTAGCCGATGGTGGTCTC-3'humanGAPDHF5'-GGGAAACTGTGGCGGAT-3'302R5'-GAGGAGTGGGTGTCGCTGTTG-3'

1.4MMP3蛋白水平的檢測

用RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)。用BCA試劑盒測定蛋白樣品的濃度，在10%分離膠后電泳分離不同的蛋白，把蛋白質(zhì)從凝膠中電轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用10%的脫脂奶粉的封閉。用1000倍稀釋的抗MMP3抗體作為一抗，用5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液發(fā)光，用成像系統(tǒng)成像。

1.5miR-17功能模擬實驗

為了研究miR-17對HDFs細(xì)胞活性的影響，在細(xì)胞中上調(diào)或抑制miR-17的活性，觀察細(xì)胞在紫外照射后的活力。miR-17的功能模擬物(miR-17 mimic)、miR-17 mimic的陰性對照物(miR-control)、miR-17的功能抑制物(anti-miR-17)及miR-control的功能抑制物(anti-miR-control)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。上述RNA-oligonucleotides的序列見表2。

按照2×104個/孔的密度把HDFs細(xì)胞接種于48孔板中，共設(shè)5個組：對照組、miR-control、miR-17 mimic、antimiR-17和anti-miR-control。用Lipofectam-ine2000把50 ng miR-17 mimic、miR-control，anti-miR-17或anti-miR-control瞬時轉(zhuǎn)染入HDFs細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，用紫外照射細(xì)胞，收集樣本檢測MMP3表達(dá)。

表2小分子RNA的序列

Table 2The sequence of RNA-oligonucleotides

miRNA 序列 miR-17Sense:5'-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3'Antisense:5'-CATCCTGCACTGTAAGCACTTTG-3'miR-controlSense:5'-UUCUCCGAACGUGUGUCACGUTT-3'Antisense:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'anti-miR-175'-CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3'anti-miR-control5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞上調(diào)MMP3的表達(dá)水平

為了檢測MMP3 mRNA的表達(dá)水平，用real-time PCR檢測了MMP3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：人皮膚成纖維細(xì)胞在接受3種不同劑量(2.5,5.0,7.5 J/cm2)UVA照射后2 h均有MMP3 mRNA 升高，不同劑量組與對照組之間相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖1)。其中2.5 J/cm2組MMP3 mRNA水平與5.0 J/cm2組和7.5 J/cm2組相比顯著降低，而5.0 J/cm2組與7.5 J/cm2組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

與對照組比較，**P<0.01圖1　不同劑量UVA輻射后2 h人皮膚成纖維細(xì)胞MMP3 mRNA表達(dá)水平(n=3)Figure 1　The mRNA levels of MMP3 in HDFs after exposed to different doses of UVA for 2 h(n=3)

用Western blot檢測了UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞MMP3蛋白的表達(dá)，灰度值分析結(jié)果顯示：人皮膚成纖維細(xì)胞在接受3種不同劑量(2.5,5.0和7.5 J/cm2)UVA照射后2 h MMP3蛋白相對表達(dá)量分別為3.42±0.33，5.61±0.67和5.82±0.57，不同劑量組與對照組(0 J/cm2)之間相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2)，MMP3蛋白表達(dá)隨UVA輻射劑量增加升高。

圖2　不同劑量UVA輻射后2 h對人皮膚成纖維細(xì)胞MMP3蛋白表達(dá)的影響Figure 2　Protein expression of MMP3 in HDFs after exposed to different doses of UVA for 2 h

2.2UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞下調(diào)了miR-17的表達(dá)水平

Real-time PCR檢測UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞miR-17的表達(dá)水平顯示：人皮膚成纖維細(xì)胞miR-17表達(dá)水平在2.5，5.0，7.5 J/cm2UVA輻射后2 h分別為0.25±0.02，0.72±0.04和0.77±0.03，不同劑量組與對照組之間相比差異有顯著性(P<0.01)，不同劑量組的miR-17表達(dá)水平較對照組有所降低(見圖3)。

2.3miR-17對人成纖維細(xì)胞中MMP3表達(dá)的影響

我們用miR-17 mimic、miR-control、anti-miR-17及anti-miR-control分別轉(zhuǎn)染HDFs細(xì)胞后，經(jīng)5.0 J/cm2紫外照射，檢測MMP3的蛋白水平，結(jié)果表明miR-17 mimic組MMP3的蛋白水平低于miR-control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)；而anti-miR-17對MMP3的蛋白水平無顯著影響。

與對照組比較，**P<0.01圖3　不同劑量UVA輻射后2 h人皮膚成纖維細(xì)胞miR-17表達(dá)水平(n=3)Figure 3　The levels of miR-17 in HDFs after exposed to different doses of UVA for 2 h(n=3)

圖4　miR-17 mimic、miR-control、anti-miR-17及anti-miR-control分別轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞對MMP3蛋白表達(dá)的影響(與對照組比較，*P<0.05)Figure 4　Protein expression of MMP3 in HDFs after transfected with miR-17 mimic, miR-control, anti-miR-17 and anti-miR-control(vs control group,*P<0.05)

3討論

光老化是由于長期日光曝露引發(fā)的皮膚損傷，它表現(xiàn)為：皮膚松弛，皺紋增多且粗大，皮膚增厚，粗糙，色素沉著，毛細(xì)血管擴(kuò)張，特別需要注意的是光老化易并發(fā)皮膚腫瘤。一般認(rèn)為，光老化是由于紫外輻射影響到HDFs功能，導(dǎo)致膠原表達(dá)下降、基質(zhì)金屬蛋白酶分泌增強(qiáng)，引起皮膚結(jié)締組織中膠原纖維損傷所致[10]。近年來有研究顯示紫外輻射可以影響到miRNA的表達(dá)改變，因此miRNA在光老化過程中的作用受到重視。

miRNA廣泛存在于多種真核生物中。雖然它們不編碼任何蛋白，但它們可通過與mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，引起mRNA的降解或是抑制翻譯的進(jìn)行。通過對基因組結(jié)構(gòu)的分析，研究人員推測在人的基因組中存在1 000個以上的miRNA基因[11]。單個miRNA可調(diào)節(jié)200個以上的靶基因，目前已知1/3以上的調(diào)節(jié)增殖、分化、發(fā)育、代謝、凋亡及其他生理活動的基因受到miRNA的調(diào)節(jié)[3]。因此，miRNA表達(dá)的改變會影響特定病理或生理現(xiàn)象的發(fā)生、發(fā)展及遷延，闡明miRNA在特定疾病中的作用對于研究疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

miR-17又被稱為miRNA91，位于人染色體13q31.3，是目前研究較多的一種小RNA。大量研究表明miR-17是c-Myc信號網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，它通過調(diào)節(jié)E2F1表達(dá)影響細(xì)胞周期[12]；miR-17還可調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞歸巢[13]、單核細(xì)胞生成[14]。miR-17還影響結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)[15]，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[16]。但是目前miR-17在皮膚的病理生理過程中的作用機(jī)制還不清楚，但本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量UVA輻射HDFs后，MMP3的表達(dá)顯著升高而miR-17的表達(dá)顯著降低，且miR-17轉(zhuǎn)染HDFs后再UVA輻射可使MMP3的蛋白水平顯著降低。故人皮膚成纖維細(xì)胞光老化模型中UVA可導(dǎo)致miR-17表達(dá)的下降，從而負(fù)性調(diào)節(jié)MMP3的表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，miR-17的表達(dá)可受到紫外輻射的影響，而生物信息學(xué)以及文獻(xiàn)報道說明了MMP3是miR-17的靶基因，且體外驗證了miR-17可以調(diào)控MMP3的表達(dá)[8]。MMPs參與正常細(xì)胞外基質(zhì)降解的生理過程，包括組織重塑和器官發(fā)育過程，同時還調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成等[17,18]。其中MMP3作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，主要的作用是降解纖維結(jié)合素、層粘連蛋白、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅵ型膠原、Ⅹ型膠原以及軟骨蛋白聚糖。早期的研究還表明MMP3可增加細(xì)胞的凋亡[19]。所以在本研究的人皮膚成纖維細(xì)胞光老化模型中UVA可導(dǎo)致miR-17表達(dá)的下降，從而負(fù)性調(diào)節(jié)MMP3的表達(dá)，進(jìn)而可能造成皮膚成纖維細(xì)胞的凋亡以及降解細(xì)胞外基質(zhì)。本研究結(jié)果為深入了解光老化的分子機(jī)制提供了新的視角，但是紫外輻射影響miR-17表達(dá)的機(jī)制，以及miR-17在光老化中具有什么樣的作用，仍需進(jìn)一步研究。

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Regulation effect of miR-17 on ultraviolet A-induced photoageing of human dermal fibroblasts

SONG Jianwen1, ZHANG Jinghua2, SONG Jiansi3*

(1DepartmentofDermatology,Xi’anChildren’sHospital,Xi’an710003,China;2DepartmentofPre-examinationandTriage,Xi’anChildren’sHospital;3DepartmentofPhysicalEducation,ShaanxiUniversityofScienceandTechnology;*Correspondingauthor,E-mail:jian-ssong@126.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of miR-17 on ultraviolet A(UVA)-induced skin photoageing.MethodsThe primary human dermal fibroblasts(HDFs) from human skin were isolated and cultured. After exposed to different doses of UVA (0, 2.5, 5.0,7.5 J/cm2), the mRNA and protein levels of metal matrix proteinase 3 (MMP3) in HDFs were detected by real-time PCR and Western blot respectively, and the level of miR-17 was detected by real-time PCR. MiR-17 mimic, miR mimic control, anti-miR-17 and anti-miR mimic control were respectively transfected into HDFs before UVA exposure, and then the protein level of MMP3 was detected.ResultsAfter exposed to UVA, the expression of MMP3 was significantly increased(P<0.01), while the level of miR-17 was significantly decreased(P<0.01). The expression of MMP3 and the level of miR-17 in 2.5 J/cm2 group were significantly lower than in 5.0 J/cm2 group and 7.5 J/cm2 group(P<0.05). When HDFs were exposed to UVA after transfected with miR-17 mimic, the protein level of MMP3 in miR-17 mimic group was significantly lower than in miR-control group(P<0.05), but there was no difference between anti-miR-17 group and its control group. ConclusionUVA could down-regulate the levels of miR-17 and miR-17 thus down-regulating the expression of MMP3 in HDFs photoageing model.

Key words:photoageing;human dermal fibroblasts;ultraviolet A;miR-17;metal matrix proteinase-3

[收稿日期：2015-10-20]

作者簡介：宋健文，女，1971-09生，博士，副主任醫(yī)師，E-mail：freedomsong@163.com.

中圖分類號：R751

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0046-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.011

基金項目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃基金資助項目(2013JM4060)；陜西省科技廳社會攻關(guān)基金資助項目(2014k11-05-03)