羅秋琦 曾志雄

摘要：【目的】闡明GS3蛋白在水稻中的調控機制，為解析植物G蛋白的結構及完善G蛋白的調控網(wǎng)絡打下基礎。【方法】分別采用表達載體pGEX-6p-1和pET-28b-sumo誘導表達GS3蛋白N端結構域OSR和GS3蛋白C端結構域，再使用凝膠過濾柱Superdex 200/75 10/300和陰例子交換層析柱Mono Q 5/50純化表達蛋白，通過篩選優(yōu)化晶體和X射線衍射的方法對GS3及GS3與Gβ共表達復合物的結構進行研究?！窘Y果】將構建的重組蛋白OSR-pGEX-6p-1與GβN- pET-28b-sumo轉入大腸桿菌BL21（DE3）中共表達，經(jīng)GST beads親和層析可獲得2條條帶，分別為OSR-GST（31 kD）和GβN-sumo（26 kD），再過Ni2+ beads親和層析同樣有2條條帶，而SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示有4條條帶，分別為GST（26 kD）、sumo（17 kD）、GβN（9 kD）和OSR（5 kD）。經(jīng)陰例子交換層析柱Mono Q 5/50分離純化可獲得GβN（9 kD）和OSR（5 kD）二者的復合物。將純化后的復合物濃縮至12 mg/mL進行晶體初篩，但未獲得結晶?！窘Y論】GS3和Gβ互作是通過GS3蛋白N端結構域OSR與Gβ N端結構域的結合而實現(xiàn)，其結果符合經(jīng)典的G蛋白異源三聚體模型。

關鍵詞： 水稻；GS3蛋白；Gβ蛋白；原核表達；結晶初篩

中圖分類號： S511；Q518.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）09-1450-07

Abstract：【Objective】Regulation mechanism of GS3 protein in rice was investigated， in order to lay foundation for analyzing structure of plant G protein and perfecting regulation network of G protein. 【Method】N-terminal domain of GS3 protein OSR and C-terminal domain of GS3 protein were expressed by inducing expression vectors pGEX-6p-1 and pET-28b-sumo， respectively. Then the gel filtration columns superdex 200/75 10/300 and ion exchange column Mono Q 5/50 were used to purify protein. The structures of GS3 and co-expression complex of GS3 and Gβ were studied by optimizing crystal and X-ray diffraction. 【Result】The constructed recombinant proteins OSR-pGEX-6p-1 and GβN-pET-28b-sumo were co-expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. Then two bands were obtained by GST beads affinity chromatography， which were OSR-GST（31 kD） and GβN-sumo（26 kD）， respectively. After Ni2+ beads affinity chromatography， two bands were still found. However， SDS-PAGE results showed that， four bands were found， including GST（26 kD）， Sumo（17 kD）， GβN（9 kD） and OSR（5 kD）. The complex of GβN（9 kD） and OSR（5 kD） were obtained by separation and purification with ion exchange column Mono Q 5/50. The purified complex was concentrated to 12 mg/mL for crystal screening， but no crystal was obtained. 【Conclusion】G protein in rice is consistent with the classical heterotrimeric G protein model due to interaction of GS3 and Gβ that GS3 N-terminal domain OSR was integrated with Gβ N-terminal.

Key words： rice； GS3 protein； Gβ protein； prokaryotic expression； crystal screening

0 引言

【研究意義】水稻是世界最重要的糧食作物之一，也是單子葉植物基因組研究的重要模式植物。雖然雜交育種的成功促使水稻產(chǎn)量得到較大提高，但隨著人口的增長和人民生活水平的提高，水稻產(chǎn)量和品質在未來很長一段時間內仍需繼續(xù)提高和改良。水稻產(chǎn)量是一個復雜的數(shù)量性狀，衡量水稻產(chǎn)量主要有3個因素，即單株穗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重（Botella，2012），其中粒重又與谷物的大小和形狀密切相關。近二十年來，研究人員一直在開展關于控制水稻產(chǎn)量基因的克隆工作，如Fan等（2006）通過圖位克隆的方法克隆出控制水稻粒型的基因GS3，Mao等（2010）從DNA水平證明了GS3蛋白是水稻粒型的負調控因子。GS3蛋白是G蛋白家族中的一員，參與調控多種生理作用，因此，探明GS3蛋白的具體作用機制，對控制水稻產(chǎn)量基因的深入研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】異源三聚體G蛋白是一種非常保守的膜信號轉導蛋白，由α、β和γ三個亞基組成。目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)有23個Gα、6個Gβ和12個Gγ；在植物中僅發(fā)現(xiàn)1個Gα、1個Gβ和3個Gγ（Mason and Botella，2001）。GS3為水稻Gγ中的一員，與另外兩個γ亞基的不同在于除了N端傳統(tǒng)的γ-like結構域外，其C端還有一段100～200個氨基酸組成的富含半胱氨酸區(qū)域。動物G蛋白可在GPCR的作用下被激活，異源三聚體分解成兩個有功能的部分Gα和Gβγ二聚體（Fukuoka et al.，1998），在該反應中Gβ與Gγ在細胞內是共同以一個功能單位來發(fā)揮作用，是不可分割的單元（Li et al.，2004；Kovach et al.，2007；Jones et al.，2011）。但也有研究發(fā)現(xiàn)植物G蛋白的激活不需要GPCRs，能夠自發(fā)地結合GTP分解成兩個有功能的部分（Kovach et al.，2007）。Gα亞基及Gβγ二聚體兩部分既協(xié)同又獨立地調控植物的生命進程。利用功能缺失突變體發(fā)現(xiàn)Gα與植物氣孔關閉、種子萌發(fā)、氧壓等一系列活動有關，而Gβγ參與花葉果實的生長、真菌防御、離子通道、根的萌發(fā)等過程（Takeuchi et al.，2000；Trusov et al.，2007）。【本研究切入點】至今，有關GS3蛋白結構的研究鮮有報道，植物中GS3與Gβ蛋白的結合是否符合經(jīng)典的G蛋白激活機制也有待進一步驗證?！緮M解決的關鍵問題】通過對GS3蛋白N端OSR結構域及Gβ蛋白N端結構域進行共表達純化，并對純化到的蛋白進行晶體初篩，旨在初步驗證植物中GS3與Gβ蛋白的結合機制，為解析植物G蛋白的結構及完善G蛋白的調控網(wǎng)絡打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α用于普通克隆；大腸桿菌BL21（DE3）用于原核表達；載體pGEX-6P-1（GST標簽）用于構建表達蛋白載體；pET-28b-sumo（His標簽）用于構建表達蛋白載體。限制性內切酶購自TaKaRa和Thermo公司；T4 DNA連接酶購自Thermo公司；DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司； PageRulerTM Prestained Protein Ladder購自Thermo公司；卡那霉素（Kan）和氨芐青霉素（Amp）及異丙基-

β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR EsTaq Mix及快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；引物合成及測序由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司和英濰捷基（上海）貿易有限公司完成。

1. 2 生物信息學分析

氨基酸的保守性結構域、同源性和理化性質分別利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）、NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和PROTPARAM（http：//web.expasy.org/protparam/）進行預測；利用Clus-talOmega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行氨基酸的多序列比對；利用PHYRE2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對氨基酸的二級結構進行預測。

1. 3 載體構建

根據(jù)cDNA序列及二級結構分析預測結果設計引物，引物前端含有Bgl Ⅱ酶切位點（AGATCT），后端引物含Not Ι酶切位點（GCGGCCGC），并在后端引物酶切位點之前加入終止子（TAA）（表1）。以cDNA為模板進行PCR擴增，用BglⅡ和Not Ι限制酶雙酶切擴增片段。用BamH Ι和Not Ι限制酶雙酶切表達載體pGEX-6p-1和pET-28b-sumo。將酶切后的片段與酶切后的載體用T4連接酶連接。轉化DH5α菌株，挑單克隆培養(yǎng)后，提質粒進行酶切驗證，最后測序獲得正確的質粒。

1. 4 蛋白表達

1. 4. 1 蛋白表達和純化 將成功重組且測序正確的質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取單菌落，接種于含有相應抗性的的LB液體培養(yǎng)基（100 μg/mL Amp或50 μg/mL Kan）中。37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，誘導蛋白表達，20 ℃培養(yǎng)12～16 h，4000 r/min離心15 min后收集菌體。將獲得的菌體用裂解液[50 mmol/L Tris（pH 8.0）、400 mmol/L NaCl和10%（v/v）甘油]重懸，隨后用超聲破碎儀（SONICS）破碎細胞，離心去除細胞碎片。收集上清液，將其加入用裂解液平衡好的樹脂。親和純化帶His標簽的蛋白所用樹脂為Qiagen的Ni-NTA agarose，親和純化帶GST標簽的蛋白所用樹脂為GE Healthcare的Glutathione Sepharose 4B。純化得到帶標簽的目的蛋白后， 加入U1p1和3C酶于4 ℃過夜酶切，分別切除His標簽蛋白和GST標簽蛋白。隨后將洗下的蛋白用超濾管（Millipore）濃縮至適當體積，使用凝膠過濾柱Superdex 200/75 10/300（GE Healthcare）和陰例子交換層析柱Mono Q 5/50（GE Healthcare）在AKTA Avant（GE Healthcare）蛋白純化儀上對蛋白進行進一步純化。

1. 4. 2 蛋白共表達親和層析 將構建的兩個或多個具有相容性的表達載體轉入同一大腸桿菌BL21（DE3）中，借助不同的蛋白標簽，通過兩步親和純化，SDS-PAGE檢測，直觀驗證蛋白間的是否存在相互作用，減少或避免酵母雙雜交等方法中的假陽性。

1. 5 結晶條件初篩與晶體優(yōu)化

使用Hampton Research和EMERALD BIO公司的Crystal Screen、Crystal Screen2、Index、Wizard等稀疏矩陣結晶篩選試劑盒進行晶體條件的初篩。采用座滴氣相擴散法，將各條件的試劑分別取50.0 μL分裝到96孔板中，用微量移液器吸取0.4 μL蛋白樣品和0.4 μL結晶試劑于座滴孔中，用封口膜（Hampton）密封，于4 ℃或16 ℃環(huán)境下生長。在得到初始結晶條件后，采用沉淀劑濃度梯度、pH梯度、結晶溫度、添加劑篩選及去垢劑篩選等方法對該條件進行調整和優(yōu)化，以得到最佳衍射能力的晶體。

1. 6 X射線衍射數(shù)據(jù)收集

初篩晶體在上海同步輻射中心（SSRF，上海）的BL18U1、BL19U1等線站進行衍射及數(shù)據(jù)收集。

2 結果與分析

2. 1 GS3基因與Gβ基因的序列分析及克隆

2. 1. 1 GS3蛋白、Gβ蛋白保守結構域的預測結果 在SMART保守結構域的預測網(wǎng)站上，輸入GS3和Gβ的氨基酸序列，將GS3全長蛋白劃分為OSR20-64、TM91-118、TNFR121-155和VWFC156-230共4個結構域；將Gβ全長蛋白劃分為GβN1-79和GβC87-374 2個結構域。

2. 1. 2 GS3基因與Gβ基因克隆結果 依據(jù)2.1.1中的分析預測結果設計引物，進行PCR擴增。各片段理論如下：OSR20-64 132 bp，TM+TNFR+VWFC 417 bp，TNFR+VWFC 327 bp，Gβ1-378 1134 bp，Gβ1-79 237 bp，Gβ87-378 873 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示擴增出的DNA片斷與片斷理論大小一致。

2. 2 表達載體的構建

PCR產(chǎn)物經(jīng)快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化后，進行Bgl Ⅱ和NotⅠ雙酶切，空載pGEX-6P-1和pET-28b-sumo分別進行BamHⅠ和NotⅠ雙酶切處理，分別純化后利用T4連接酶23 ℃連接30 min，轉化大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落，37 ℃培養(yǎng)過夜后利用質粒小提試劑盒提取質粒，進行PCR鑒定。質粒測序結果與理論序列比對，結果完全一致。將測序正確的質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中進行蛋白誘導表達。

2. 3 GS3蛋白N端結構域OSR的原核表達、純化及結晶

將構建好的OSR-pGEX-6p-1重組蛋白進行大量表達。用GST beads進行親和層析后，OSR-GST達到較高純度，但目的條帶下方仍有一部分雜帶（圖1）。采用柱上酶切的方法，在清洗完雜蛋白后，用裂解液重懸beads，加入3C酶，混勻，4 ℃過夜酶切。隨后穿留下目的蛋白，用3 kD超濾管濃縮至1 mL。1 mL蛋白樣品經(jīng)過Superdex 200 10/300凝膠過濾層析進一步純化（圖2）。取樣進行SDS-PAGE凝膠電泳。從圖3可看出，經(jīng)過柱上酶切和凝膠過濾層析后，目的蛋白OSR和標簽GST已經(jīng)分開，最后得到較純的OSR蛋白。濃縮至15 mg/mL，進行晶體初篩。

在72 h內，有兩個條件出現(xiàn)了晶體，分別為：（1）10% PEG-8000（沉淀劑），200 mmol/L NaCl，100 mmol/L磷酸二氫鉀/磷酸氫二鈉，pH 6.2；（2）30% PEG-4000（沉淀劑），200 mmol/L氯化銨/10 mmol/L二水氯化鈣（鹽），50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5。

將初篩晶體在上海同步輻射中心（SSRF，上海）的BL18U1線站進行衍射。結果顯示：（1）中的晶體是鹽晶，而非蛋白晶體；（2）中的晶體無衍射點，后續(xù)對結晶條件進行進一步優(yōu)化，但未能獲得較好衍射的晶體。

2. 4 GS3蛋白C端結構域的表達及純化結果

將構建的TM+TNFR+VWFC-pET-28b-sumo和TNFR+VWFC-pET-28b-sumo重組蛋白進行大量表達。用Ni2+ beads進行親和層析，TM+TNFR+VWFC-sum蛋白表達，但sumo標簽有斷裂脫落情況，TNFR+VWFC- sumo也存在相同的情況（圖4）。洗脫下來的蛋白加入Ulp1酶，4 ℃過夜酶切后，蛋白大量沉淀。說明這兩個蛋白在有sumo融合蛋白存在的情況下，表達比較穩(wěn)定；但切掉sumo標簽后，蛋白性質發(fā)生變化，不穩(wěn)定且出現(xiàn)沉淀。

2. 5 Gβ全長及截短片段的表達及純化結果

2. 5. 1 Gβ蛋白全長表達 將構建好的Gβ-pGEX- 6P-1重組蛋白進行大量表達。用GST beads進行親和層析后，目的蛋白有表達，但形成包涵體。

2. 5. 2 Gβ蛋白結構域的表達 將構建好的GβN-pET- 28b-sumo和GβC-pET-28b-sumo重組蛋白進行大量表達。用Ni2+ beads進行親和層析后，如圖5-B中箭頭所示，GβC-sumo目的蛋白表達，但形成包涵體；GβN- sumo有蛋白被洗脫下來，但sumo標簽有斷裂脫落的情況，推斷GβN-sumo蛋白性質也不穩(wěn)定。

2. 6 Gβ蛋白N端結構域（GβN）與OSR共表達及復合物純化

2. 6. 1 GβN與OSR共表達 已有研究表明，OSR是通過與Gβ的N端結合形成Gβγ二聚體而行使功能（Pellegrino et al.，1997）。故將OSR-pGEX-6p-1與GβN-pET-28b-sumo轉入大腸桿菌BL21（DE3）中共表達。用GST beads進行親和層析，可看到洗脫液中有2條條帶，分別符合OSR-GST（31 kD）和GβN-sumo（26 kD）的理論分子量（圖6-A）。將洗脫的樣品再過Ni2+ beads親和層析，再次洗脫下來的樣品同樣有這2條條帶（結果未顯示）。在洗脫的樣品中，加入Ulp1和3C酶，切除標簽。取樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，如圖6-B中顯示，4條泳帶分別為GST（26 kD）、sumo（17 kD）、GβN（9 kD）和OSR（5 kD）。

綜上所述，通過OSR與Gβ的共表達，穿流GST beads時，不帶有GST標簽額GβN-sumo也可以被捕獲；穿流Ni2+ beads時，同樣，不帶有His標簽的OSR也被捕獲。這一結果可驗證OSR與GβN存在互作。

2. 6. 2 GβN與OSR復合物的純化 將2.6.1中酶切后的蛋白樣品，換Buffer至鹽濃度為100 mmol/L的NaCl。4 ℃離心10 min，上樣至陰例子交換層析柱Mono Q 5/50（GE Healthcare），結果如圖7所示，黑色曲線為A280吸收曲線，圖中有3個明顯的峰型。收集各峰型的樣品進行SDS-PAGE電泳，如圖8所示，GβN與OSR的復合物在上樣時不掛柱，出峰（圖7箭頭所示處）。將得到的復合物濃縮至12 mg/mL，進行晶體初篩，但未獲得結晶。后續(xù)將調整蛋白濃度及結晶溫度等，對結晶條件進行優(yōu)化。

3 討論

繼動物和真菌系統(tǒng)之后，擬南芥和水稻已成為研究G蛋白及其信號系統(tǒng)的重要模式系統(tǒng)（Urano et al.，2013）。植物的G蛋白調控系統(tǒng)和真菌及動物不同，為研究G蛋白的信號和網(wǎng)絡構架的進化提供了方向和線索。水稻的谷物粒型與水稻的產(chǎn)量和品質密切相關。前人已克隆獲得與水稻粒型相關的基因GS3，從DNA水平證明了GS3蛋白是水稻粒型的負調控因子，但對GS3蛋白的調控機制、作用位點及結合的底物仍了解甚少。對于植物G蛋白的結構及其與動物G蛋白的異同，目前還有待進一步了解。GS3相對于傳統(tǒng)的Gγ，多了一端富含半胱氨酸的區(qū)域。從GS3的生理功能來看，主要起著調控作用的區(qū)域是OSR，而富含半胱氨酸的區(qū)域對其可能存在負調控作用。本研究利用原核表達系統(tǒng)，對OSR進行表達，獲得蛋白之后進一步除標簽純化，最后得到純度較高、均一性較好的蛋白用于結晶，為GS3蛋白的結構研究打下了良好的基礎。

在已知的異源三聚體G蛋白中，Gβ和Gγ一直作為一個整體來行使功能，Gβ與不同的Gγ結合能夠調控不同的生命進程。本研究通過共表達的方法，初步驗證了Gβ的N端和OSR存在互作，符合經(jīng)典的G蛋白三聚體模型。通過陰離子交換層析，將GβN和OSR的復合物與GST和Sumo標簽分離，得到了純度較高且均一性較好的蛋白用于結晶。雖然通過結晶初篩未能獲得晶體，但結果已驗證了G蛋白異源三聚體結構的高度保守性，為后續(xù)的功能驗證提供了結構基礎。

4 結論

GS3和Gβ互作是通過GS3蛋白N端結構域OSR與Gβ N端結構域的結合而實現(xiàn)，結果符合經(jīng)典的G蛋白異源三聚體模型。

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（責任編輯 王 暉）