李珣　陳思宇　胡傳活　王曉曄

摘要：【目的】構(gòu)建 PK-15細(xì)胞酵母雙雜交三框cDNA文庫，為深入研究豬偽狂犬病病毒（PRV）與宿主細(xì)胞間的相互作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。【方法】提取PK-15細(xì)胞總RNA，采用SMART和LD-PCR合成全長的雙鏈cDNA（ds cDNA），并對(duì)其進(jìn)行均一化和Sfi I酶切處理。處理后的ds cDNA分別連接3種閱讀框pGADT7-Sfi I載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BH5α構(gòu)建三框cDNA初級(jí)文庫，取三框cDNA初級(jí)文庫進(jìn)行混合擴(kuò)增，通過滴度測(cè)定和PCR鑒定其庫容量和基因重組率，最后收集文庫細(xì)菌提取文庫質(zhì)粒?！窘Y(jié)果】3種讀碼框cDNA文庫的庫容量分別為3.0×106、2.0×106和2.0×106 CFU，文庫實(shí)際擴(kuò)增基數(shù)>150萬CFU；一號(hào)和三號(hào)讀碼框的基因重組率均為100%，二號(hào)讀碼框的基因重組率大于93%。cDNA文庫外源基因插入片段長度在500～3000 bp。cDNA文庫質(zhì)粒濃度約1.0 mg/mL，質(zhì)粒收獲量約3.0 mg?！窘Y(jié)論】構(gòu)建的PK-15細(xì)胞酵母雙雜交三框cDNA文庫具有較高的重組率和庫容量，符合酵母雙雜交篩選要求，可用于研究PRV與PK-15細(xì)胞間的相互作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞： PK-15細(xì)胞；酵母雙雜交；三框cDNA文庫；均一化；豬偽狂犬病病毒（PRV）

中圖分類號(hào)： S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）05-0726-05

Abstract：【Objective】Yeast two-hybrid three-frame cDNA library of PK-15 cells was constructed， in order to lay the foundation for investigating interaction mechanism between pseudorabies virus（PRV） and its host cells. 【Method】Total RNA was extracted from PK-15 cells， and the full-length double-strand cDNA（ds cDNA） was synthesized using SMART and LD-PCR， which was ligated to three-frame expression vector pGADT7-Sfi I after nomalization and Sfi I digestion， respectively. The ligation product was transformed into Escherichia coli to construct primary three-frame expression cDNA library. Three primary cDNA libraries were mixed and amplified. The capacity and recombination rate of library were determined by titer test and PCR identification. Finally， all bacteria were collected to extract library plasmid. 【Result】The capacities of three reading frame libraries were 3.0×106， 2.0×106 and 2.0×106 CFU， respectively. The practical amplification base of library was more than 1.5 million CFU. The recombination rates of three frame libraries were 100%， more than 93% and 100%， respectively. The inserted fragment of exogenous gene was 500-3000 bp in length. The plasmid concentration of cDNA library was about 1.0 mg/mL， the plasmid yield was about 3.0 mg. 【Conclusion】The constructed yeast two-hybrid three-frame cDNA library of PK-15 cells has high capacity and recombination rate， so which meet the requirements of yeast two-hybrid screening， can be used to research interaction mechanism between PRV and PK-15 cells.

Key words： PK-15 cells； yeast two hybrid； three-frame cDNA library； normalization； pseudorabies virus（PRV）

0 引言

【研究意義】豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種豬急性傳染病，主要引起妊娠母豬繁殖障礙、育肥豬生長停滯及哺乳仔豬死亡，死亡率最高可達(dá)100%（Klupp et al.，1995；Pomeranz et al.，2005；林俊等，2016），對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害。PRV具有泛嗜性，能在多種體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，其中以PK-15細(xì)胞最敏感（殷震和劉景華，1997），但迄今為止關(guān)于PRV與PK-15細(xì)胞間相互作用的研究報(bào)道相對(duì)較少。酵母雙雜交是研究蛋白質(zhì)相互作用的一種重要技術(shù)手段（李向陽等，2015），因此構(gòu)建PK-15細(xì)胞酵母雙雜交三框cDNA文庫，可為采用酵母雙雜交技術(shù)篩選與PRV蛋白相互作用的文庫蛋白奠定基礎(chǔ)，對(duì)揭示PK-15細(xì)胞抵抗PRV復(fù)制的分子機(jī)制也具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】鑒于PK-15細(xì)胞培養(yǎng)過程中生長速率快，且細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)顯著提高，常用作構(gòu)建cDNA文庫的宿主細(xì)胞（王國棟等，2013；李文良等，2016）。田宏（2003）對(duì)豬瘟病毒（Clssical swine fever virus，CSFV）及其全長cDNA在PK-15細(xì)胞中的增殖表達(dá)特性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSFV石門株強(qiáng)毒株能適應(yīng)PK-15細(xì)胞，其全長cDNA亦可轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，并證實(shí)病毒RNA在轉(zhuǎn)染早期表達(dá)量較低，經(jīng)過多次傳代可提高病毒的抗原產(chǎn)量。薛白（2012）利用PK-15細(xì)胞擴(kuò)增PRV，成功構(gòu)建了PRV microRNA文庫，證實(shí)PRV致病過程中確有microRNA存在，且發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。王國棟等（2013）構(gòu)建了PK-15細(xì)胞cDNA T7噬菌體展示文庫，初級(jí)文庫滴度為2.0×105 PFU/mL，擴(kuò)增后滴度高達(dá)6.0×1010 PFU/mL，經(jīng)PCR鑒定其文庫重組率為95.83%。張輝（2014）利用酵母單雜交技術(shù)將合成的豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）復(fù)制起始處的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列整合到酵母染色體中構(gòu)建誘餌酵母菌株，然后采用SMART合成PK-15細(xì)胞cDNA文庫，將總cDNA與pGADT7-Rec表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化酵母誘餌菌株，通過同源重組在酵母細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建酵母單雜交cDNA文庫；同時(shí)驗(yàn)證了PK-15細(xì)胞源蛋白（AP2α2、Elf4和ISCU）表達(dá)水平對(duì)PCV2的復(fù)制調(diào)節(jié)作用，即Elf4和ISCU蛋白過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)PCV2的復(fù)制，而AP2α2蛋白過表達(dá)對(duì)PCV2的復(fù)制無顯著影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】酵母雙雜交cDNA文庫是研究蛋白質(zhì)相互作用的重要手段，但目前尚無PK-15細(xì)胞酵母雙雜交三框cDNA文庫構(gòu)建的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過構(gòu)建PK-15細(xì)胞酵母雙雜交三框cDNA文庫，進(jìn)一步明確PRV與PK-15細(xì)胞間的相互作用關(guān)系，為闡明宿主細(xì)胞抵抗PRV復(fù)制的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

PK-15細(xì)胞由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存提供，RNA提取試劑TRIzol Reagent購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Lambda EcoT14I digest、250 bp DNA Ladder Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，cDNA文庫構(gòu)建試劑盒Make Your Own“Mate & Plate”Library System Kit、LD-PCR試劑盒Advantage 2 Polymerase Mix購自美國Clontech公司，Trimmer-Direct cDNA Normalization Kit購自Evrogen公司，NucleoBond Xtra Maxi EF（MN）試劑盒購自Qiagen公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 PK-15細(xì)胞總RNA提取及第一鏈cDNA合成

細(xì)胞單層鋪滿80%以上、細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、狀態(tài)良好時(shí)，棄去細(xì)胞營養(yǎng)液，按TRIzol Reagent說明進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量。然后取1.0 μg總RNA，參照SMARTTM cDNA Library Construction Kit 試劑盒說明合成第一鏈cDNA。

1. 2. 2 LD-PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA（ds cDNA） 取2.0 μL第一鏈cDNA，參照Advantage試劑盒說明擴(kuò)增cDNA。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，68 ℃ 6 min（每次循環(huán)增加5 s），共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸5 min。取5.0 μL LD-PCR產(chǎn)物（ds cDNA）經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，剩余ds cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 ds cDNA均一化處理 擴(kuò)增獲得的ds cDNA按Trimmer-Direct cDNA Normalization Kit說明以DSN（Duples-specific nulease）進(jìn)行梯度稀釋。電泳檢測(cè)均一化效果，并進(jìn)行產(chǎn)物回收。

1. 2. 4 ds cDNA的Sfi I酶切處理 用限制性內(nèi)切酶Sfi I（A）和Sfi I（B）對(duì)ds cDNA進(jìn)行雙酶切，兩端產(chǎn)生不對(duì)稱黏性末端，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用膠回收試劑盒純化回收。

1. 2. 5 ds cDNA去除短片段處理 使用CHROMA SPIN-1000柱除去ds cDNA中500 bp以下的片段，并以電泳檢測(cè)去除效果。

1. 2. 6 初級(jí)cDNA文庫構(gòu)建 處理后的ds DNA與3種讀碼框pGADT7-Sfi I載體在16 ℃下連接14 h及4 ℃下連接4 h。3種連接產(chǎn)物分別采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后迅速加入SOC培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，37 ℃下?lián)u床（250 r/min）培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結(jié)束，取10.0 μL培養(yǎng)物進(jìn)行10、100和1000倍稀釋后，各取50.0 μL涂布在含Amp+抗性的瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，計(jì)算總克隆數(shù)（CFU）=培養(yǎng)基上的克隆數(shù)/50.0 μL×稀釋倍數(shù)×1×103 μL。剩余培養(yǎng)物加入甘油，-80 ℃保存。

1. 2. 7 初級(jí)cDNA文庫擴(kuò)增、PCR鑒定及質(zhì)粒提取

3種讀碼框初級(jí)cDNA文庫各取50萬CFU混合擴(kuò)增，接種到含Amp+抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，擴(kuò)增文庫。然后根據(jù)pGADT7-Rec序列設(shè)計(jì)的特異性引物（5'-GGAGTACCCATACGACGTACC-3'和5'-TATCTA

CGATTCATCTGCAGC-3'），隨機(jī)挑取48個(gè)克隆進(jìn)行文庫插入片段的多態(tài)性分析，以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。用2.0 mL文庫保存液洗脫菌落，收集菌液后采用NucleoBond Xtra Maxi EF（MN）試劑盒提取質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒濃度和質(zhì)粒收獲量統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PK-15細(xì)胞總RNA提取結(jié)果

提取的PK-15細(xì)胞總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，能清晰觀察到28S、18S及5.8S核糖體RNA特征性條帶，條帶規(guī)則且無明顯拖尾現(xiàn)象（圖1），28S和18S的亮度比約2∶1，表明總RNA沒有降解，完整性較好，符合cDNA文庫構(gòu)建要求。

2. 2 ds cDNA合成與鑒定結(jié)果

利用SMART合成cDNA第一條鏈，再通過LD-PCR合成ds cDNA，取5.0 μL LD-PCR產(chǎn)物（ds cDNA）經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，ds cDNA片段主要分布在100～6000 bp（圖2-A），說明不同大小和豐度的mRNA均得到有效反轉(zhuǎn)錄，符合cDNA文庫構(gòu)建要求。

2. 3 均一化ds cDNA鑒定結(jié)果

均一化處理后的ds cDNA也未呈現(xiàn)出特異性條帶，電泳圖為均勻的彌散帶（圖2-B），且所覆蓋的片段長度范圍與未均一化處理的ds cDNA相同。

2. 4 ds cDNA的Sfi I酶切及去除短片處理結(jié)果

利用限制性內(nèi)切酶Sfi I對(duì)均一化ds cDNA進(jìn)行酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)物均勻分布在200 bp以上（圖3），且酶切完全，能滿足構(gòu)建cDNA文庫的要求。

2. 5 cDNA文庫插入外源基因片段長度、庫容量及重組率檢測(cè)結(jié)果

通過PCR檢測(cè)插入的外源基因片段長度，結(jié)果如圖4所示，插入外源基因片段長度在500～3000 bp。根據(jù)文庫重組率計(jì)算公式：文庫重組率（%）=有插入片段的反應(yīng)個(gè)數(shù)/反應(yīng)總數(shù)×100，得出一號(hào)和三號(hào)讀碼框的基因重組率均為100%，二號(hào)讀碼框的基因重組率大于93%。構(gòu)建完成3種讀碼框cDNA初級(jí)文庫，庫容量分別為3.0×106、2.0×106和2.0×106 CFU。從3種讀碼框的cDNA初級(jí)文庫中各取50萬CFU混合擴(kuò)增，得到文庫試劑擴(kuò)增基數(shù)>150萬CFU。采用NucleoBond Xtra Maxi EF（MN）試劑盒提取質(zhì)粒，其中質(zhì)粒濃度約1.0 mg/mL，質(zhì)粒收量約3.0 mg，表明所構(gòu)建的三框cDNA表達(dá)文庫具有較高的重組率和庫容量，符合酵母雙雜交篩選要求。

3 討論

RNA的完整性和高純度是構(gòu)建cDNA文庫的基礎(chǔ)（Zhu et al.，2001；王晨等，2010）。本研究提取PK-15細(xì)胞總RNA，得到28S和18S核糖體RNA的亮度比為2∶1，有清晰的特征性條帶，表明RNA的信息鏈完整，沒有發(fā)生降解，可用于構(gòu)建cDNA文庫。常規(guī)的建庫需在合成cDNA雙鏈兩端通過連接加上相同或不同的接頭，以相應(yīng)的酶切后再插入載體中。由于連接效率低，通常導(dǎo)致低豐度或較長的cDNA信息丟失而失去應(yīng)有的代表性。為了避免丟失重要的cDNA信息，本研究采用由Chenchik等（1996）提出的SMART構(gòu)建文庫，利用SMARTTM cDNA Library Construction Kit試劑盒中的SMART引物與CDS引物分別包含的不同Sfi I酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，由于Sfi I酶的識(shí)別序列是CCGGNNNNN

CCGG，其中的5個(gè)堿基（NNNNN）為隨機(jī)序列，即兩個(gè)引物中間的5個(gè)堿基不相同。對(duì)分別帶有不同引物的cDNA利用SMART進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行Sfi I酶切，得到不同黏性末端的cDNA，因此可定向地插入特定載體中，且保證生物信息的完整性。

在構(gòu)建cDNA文庫時(shí)，小片段cDNA比大片段cDNA更容易擴(kuò)增。因此，克隆稀有表達(dá)基因較困難，不但其轉(zhuǎn)錄水平低，而且復(fù)雜性和轉(zhuǎn)錄成本較高（王藝?yán)诤蛷堊悠剑?003）。為增加稀有表達(dá)基因在cDNA文庫中的出現(xiàn)頻率，提高發(fā)現(xiàn)新基因的效率，本研究采用Trimmer-Direct cDNA Normalization Kit試劑盒，在cDNA復(fù)性時(shí)選擇DSN降解ds cDNA。DSN熱穩(wěn)定性好，不會(huì)作用于單鏈DNA。DSN能有效去除高豐度的cDNA，且不損傷大片段cDNA，即要求文庫中cDNA片段長度的覆蓋范圍與未均一化處理的相同（王淑紅等，2008），從而提高文庫中cDNA豐度的均一性。

評(píng)價(jià)一個(gè)完整cDNA文庫的質(zhì)量主要從兩個(gè)方面進(jìn)行：（1）文庫表征性，即文庫中反映來源細(xì)胞表達(dá)信息的完整度，可用文庫的庫容量來衡量。庫容量是構(gòu)建初級(jí)cDNA文庫中獨(dú)立重組子克隆數(shù)，其大小決定了文庫的覆蓋度是否完整。通常得到一個(gè)具備完整信息的cDNA文庫至少需含有1×106 CFU的庫容量（Ohara and Temple，2001）。本研究通過對(duì)構(gòu)建的PK-15細(xì)胞酵母雙雜交三框cDNA文庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3種讀碼框cDNA文庫的庫容量分別為3.0×106、2.0×106和2.0×106 CFU，均符合建庫要求，保證了文庫的覆蓋度。（2）重組cDNA序列完整性，即基因的重組率和插入片段長度（王淑紅等，2008）。細(xì)胞mRNA均由5'端非翻譯區(qū)、編碼區(qū)和3'端非編碼區(qū)組成，構(gòu)建文庫的完整性必須要求重組cDNA片段足夠長，且能反應(yīng)基因本身的結(jié)構(gòu)。本研究構(gòu)建一號(hào)和三號(hào)讀碼框的每個(gè)菌落均有外源基因插入，二號(hào)讀碼框的基因重組率也大于93%，cDNA文庫的插入片段均在500 bp以上，主要分布于500～2250 bp，說明文庫具有較高的重組率和完整性。本研究還發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建三框cDNA文庫是在單一cDNA文庫的基礎(chǔ)上使上游引物逐一添加1個(gè)新的堿基，讓cDNA以3種讀碼框的形式進(jìn)行表達(dá)，有效保證插入片段的正確表達(dá)產(chǎn)物能被篩選出來而不會(huì)遺漏，提高cDNA文庫的表達(dá)率。

酵母雙雜交是研究蛋白質(zhì)相互作用的有效技術(shù)手段之一，目前關(guān)于應(yīng)用酵母雙雜交研究病毒與機(jī)體間相互作用的報(bào)道逐漸增多（Pei et al.，2010；李向陽等，2015），但以酵母雙雜交篩選PRV與宿主相互作用的報(bào)道較少。本研究采用SMART結(jié)合酵母雙雜交的方法構(gòu)建cDNA文庫，不但在基因重組率和外源插入片段長度等方面符合cDNA文庫的篩選要求，而且方法簡(jiǎn)單易行，所構(gòu)建的質(zhì)粒文庫相對(duì)于噬菌體文庫具有易擴(kuò)增保存、無需體外包裝、篩選方便等優(yōu)點(diǎn)，為深入研究PRV與宿主細(xì)胞間的相互作用機(jī)制、病毒復(fù)制機(jī)制及其致病機(jī)理打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過SMART構(gòu)建PK-15細(xì)胞酵母雙雜交三框cDNA文庫，在庫容量、基因重組率和外源插入片段長度等方面均符合cDNA文庫構(gòu)建要求，且方法簡(jiǎn)單易行，符合后續(xù)文庫篩選要求，可用于深入研究PRV與宿主細(xì)胞間的相互作用機(jī)制、病毒復(fù)制機(jī)制及其致病機(jī)理。

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（責(zé)任編輯 溫國泉）