高曉華　肖雨　張明輝　安偉　何正侃　邵玲　張海強

摘要：【目的】探討13種中藥對熒光假單胞菌（Pseudamonas fluoroscens）的體外抑菌效果，為其在魚類赤皮病防治實踐中的應(yīng)用提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎闷桨宕蚩追z測熒光假單胞菌對13種中藥提取液的敏感性，用二倍稀釋法測定不同中藥對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），并選擇抑菌效果最佳的中藥為試驗藥物，進一步研究不同質(zhì)量濃度和靜置時間對中藥殺滅熒光假單胞菌效果的影響。【結(jié)果】熒光假單胞菌對烏梅、大黃高度敏感，對蘆根、黃柏、青皮、車前草、熟地黃、地榆等中度敏感，對柴胡、決明子、貫眾、麥冬、青蒿等不敏感。不同中藥提取液對熒光假單胞菌的體外抑菌效果排序為：烏梅>大黃>熟地黃=地榆>車前草>黃柏>蘆根=青皮，其中以烏梅的殺菌作用最強，MIC和MBC分別為7.813和15.625 mg/mL。隨質(zhì)量濃度的增加，烏梅提取液對熒光假單胞菌殺滅效果不斷增強，14.00～18.00 mg/mL的烏梅提取液能迅速殺滅病原菌，且靜置32 h后仍具有較強的藥效作用。【結(jié)論】烏梅提取液對熒光假單胞菌的抑菌效果最佳，在14.00～18.00 mg/mL的條件下能夠快速殺滅病原菌，在實際生產(chǎn)中可適當(dāng)加大使用劑量，充分發(fā)揮其迅速有效的治療效果。

關(guān)鍵詞： 中藥；熒光假單胞菌；抑菌效果；最小抑菌濃度（MIC）；最小殺菌濃度（MBC）

中圖分類號： S948 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）05-0748-05

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to study antibacterial effect of 13 Chinese herbal medicines on Pseudamonas fluoroscens in vitro， in order to provide scientific basis for prevention and cure of red-skin disease. 【Method】The sensitivities of P. fluoroscens to 13 species of Chinese herbal medicines were detected through punch method， and the minimum inhibitory concentration（MIC） and minimum bactericidal concentration（MBC） of different Chinese herbal medicines were determined by double dilution method. Then the Chinese herb with the best antibacterial effect was selected as experimental drug， and its antibacterial effect on P. fluoroscens was investigated under different drug concentrations and standing times. 【Result】The results showed that， P. fluoroscens were highly susceptible to Prunus mume， Rheum palmatum， intermediately susceptible to Phragmites communis， Phellodendron chinense， Citrus reticulata Blanco， Plantago depressa Willd， Sanguisorba officinalis， Phragmites communis， and insensitive to Bupleurum chinense， Cassia obtusifoli， Cyrtomii rhizome， Ophiopogon japonicas， Artemisia annua. The different Chinese herbal medicine extracts were ordered based on their inhibitory effects on P. fluoroscens， as follows： P. mume>R. palmatum>R. glutinosa=S. offieinali>P. depressa>P. chinense>P. communis=C. reticulata. Therefore， P. mume had the strongest antibacterial effect， MICs and MBCs of which were 7.813 and 15.625 mg/mL， respectively. As the increase of concentration， the antibacterial effect of P. mume on P. fluoroscens increased constantly. When the concentrations of P. mume were 14.00-18.00 mg/mL， P. fluoroscens would be killed rapidly， and its number maintained at low level after standing time of 32 h. 【Conclusion】P. mume has optimal antibacterial effect on P. fluoroscens， particularly at the concentrations of 14.00-18.00 mg/mL， P. fluoroscens will be killed rapidly. However， the drug dosage should be increased appropriately in the actual production， so as to give full play to its antibacterial effect.

Key words： Chinese herbal medicine； Pseudamonas fluoroscens； bacteriostatic effect； minimal inhibitory concentration（MIC）； minimal bactercidal concentration（MBC）

0 引言

【研究意義】熒光假單胞菌（Pseudamonas fluoroscens）為革蘭氏陰性菌，是引起淡水養(yǎng)殖魚類赤皮病的主要致病菌（耿曉修等，2006）。近年來，各地淡水養(yǎng)殖場因感染熒光假單胞菌而造成魚類發(fā)病且大批量死亡事件時有發(fā)生，給養(yǎng)殖戶造成了嚴重的經(jīng)濟損失（鄧顯文等，2010；安偉等，2014）。目前，魚類細菌性疾病的治療仍以抗生素和化學(xué)藥物為主，但抗生素的大量使用導(dǎo)致病原菌耐藥性不斷增強，同時藥物殘留會直接影響水產(chǎn)品的質(zhì)量安全（楊永仙，2008）。中藥防治細菌性疾病效果顯著，殘留量小、不易產(chǎn)生耐藥性且價格低廉（王文博等，2006；李莉等，2014；錢均祥等，2015），若能將中藥制劑推廣應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，勢必能促進水產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展?！厩叭搜芯窟M展】早在20世紀80年代就有學(xué)者提出將中藥推廣到水產(chǎn)養(yǎng)殖魚病防治中（邱敬民和劉棟成，1984），其研究主要是探討中藥對水產(chǎn)常見致病菌和寄生蟲的體外殺滅效果。宋學(xué)宏等（2001）研究了地錦草、板藍根等9種常見中藥對強毒株嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌的體外抑菌效果，結(jié)果顯示，地錦草對兩菌株的抑菌圈直徑均大于30.00 mm，具有良好的抑菌效果。陳霞等（2012）采用瓊脂擴散法測定了羅漢果、石榴皮、虎杖等47種中藥對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以石榴皮對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最佳，其最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）均為7.81 mg/mL。郝忱等（2014）研究表明，在基礎(chǔ)餌料中添加中藥復(fù)合添加劑（0.3%大黃+0.3%淫羊藿+0.2%黃芪+

0.2%板藍根）可促進克氏原螯蝦的生長，提高機體的非特異性免疫力及抵抗白斑病綜合征病毒的能力。陳琛等（2015）通過開展不同中藥對4種南美白對蝦致病弧菌的抑制試驗，發(fā)現(xiàn)五倍子、訶子、黃芩和大黃對4種致病菌的MBC為0.12～1.95 mg/mL，表明中藥含有能夠殺滅弧菌的有效成分，可用于預(yù)防由弧菌引起的南美白對蝦細菌性疾病。馬寧等（2015）研究了18種中藥浸出液對刺激隱核蟲幼蟲和包囊的體外殺滅效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以辣椒和檳榔的殺蟲效果最佳，在濃度為1 g/L時殺滅全部刺激隱核蟲幼蟲所用的時間分別為5.3±0.6和16.0±1.7 min?！颈狙芯壳腥朦c】至今，鮮見關(guān)于中藥對熒光假單胞菌的體外抑菌效果及深入觀察熒光假單胞菌隨中藥質(zhì)量濃度和放置時間變化的生長趨勢研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用平板打孔法檢測熒光假單胞菌對13種中藥的敏感性，然后以二倍稀釋法測定具有良好抑菌活性中藥對熒光假單胞菌的MIC和MBC，并選擇抑菌效果最佳的中藥為試驗藥物，進一步研究不同質(zhì)量濃度和靜置時間對熒光假單胞菌殺滅效果的影響，為中藥在魚類赤皮病防治實踐中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

熒光假單胞菌由上海市水產(chǎn)研究所病害防治室提供，13種中藥（表1）均購自上海益豐大藥房，TSA培養(yǎng)基、TSB肉湯培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1. 2 中藥提取液制備

參照丁改法等（2006）的方法制備中藥提取液。將各供試中藥置于60 ℃干燥箱中烘至恒重，取30.00 g，分別加水300.0 mL浸泡1 h后煎煮，煮沸后文火煮30 min，濾出煎液，共煎煮3次，合并濾液并濃縮至1 g/mL，121 ℃高溫濕熱滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 病原菌菌懸液制備

無菌條件下從斜面培養(yǎng)基上挑取保存的熒光假單胞菌，劃線接種到TSA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h；再挑取單個菌落接種TSB培養(yǎng)基上，30 ℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)20 h后，采用平板菌落計數(shù)法測定菌懸液濃度（李華，2006），并以無菌生理鹽水將菌懸液調(diào)至1.0×107 CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 藥敏試驗

以平板打孔法測定熒光假單胞菌對中藥提取液的敏感性。在各培養(yǎng)基上均勻涂抹100 μL熒光假單胞菌菌液，然后用直徑6 mm的打孔器打4個孔，其中3孔加入50 μL中藥提取液，另一孔加滅菌生理鹽水作陰性對照，每種藥液均設(shè)置3個重復(fù)，將其正面朝上放置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，測定抑菌圈直徑（d），并參照王淑娟（1995）的標(biāo)準進行判斷。根據(jù)熒光假單胞菌對中藥的敏感性，選擇中、高度敏感的中藥進行MIC和MBC測定。

1. 5 MIC和MBC測定

采用試管二倍稀釋法（陳霞等，2011），即每種中藥準備15支滅菌且?guī)奕?0 mL試管，各試管均加入2.0 mL菌液。第1管內(nèi)加入中藥提取原液2.0 mL，混勻后吸取2.0 mL移入第2管中，然后逐級稀釋至第13管。第14管為只加菌液不加藥液的生長對照，第15管為只加藥液不加菌液的空白對照。各試管置于30 ℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。無菌落生長、稀釋度最大的中藥提取液質(zhì)量濃度即為MIC。從所有無細菌生長的各管中分別取100 μL，涂布于無菌TSA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。培養(yǎng)基上無菌落生長的最低中藥提取液質(zhì)量濃度即為MBC。

1. 6 藥效測定

根據(jù)MIC和MBC的測定結(jié)果選擇殺滅熒光假單胞菌效果最佳的中藥提取液為供試藥物，測定不同質(zhì)量濃度和靜置時間對中藥殺滅熒光假單胞菌效果的影響。參照楊移斌等（2013b）的方法測定供試藥物的MIC和MBC范圍，即將中藥提取液加入含有2.0 mL無菌TSB培養(yǎng)基試管中，至質(zhì)量濃度分別為6.00、10.00、14.00和18.00 mg/mL，然后靜置2、8、16和32 h，再接種菌懸液至終濃度為5.0×105 CFU/mL，30 ℃下培養(yǎng)24 h后吸取100 μL進行計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 熒光假單胞菌對中藥提取液的敏感性

熒光假單胞菌對13種中藥提取液的敏感性見表1。由表1可知，烏梅、大黃提取液對熒光假單胞菌的抑菌圈直徑均大于15.00 mm，屬高度敏感；蘆根、黃柏、青皮、車前草、熟地黃、地榆等提取液的抑菌圈直徑為10.00～15.00 mm，屬中度敏感；柴胡、決明子、貫眾、麥冬、青蒿等提取液的抑菌圈直徑均小于10.00 mm，為不敏感。

2. 2 中藥提取液對熒光假單胞菌的MIC和MBC

由表2可知，烏梅提取液對熒光假單胞菌的MIC為7.813 mg/mL、MBC為15.625 mg/mL，殺菌作用最強；大黃提取液的MIC、MBC分別為15.625和31.250 mg/mL，殺菌作用較好；地榆、黃柏、車前草、熟地黃等提取液對熒光假單胞菌的MBC為62.500～250.000 mg/mL，蘆根、青皮提取液的MBC均為500.000 mg/mL，殺菌效果較差。不同中藥提取液對熒光假單胞菌的體外抑菌效果排序為：烏梅>大黃>熟地黃=地榆>車前草>黃柏>蘆根=青皮。因此，選取烏梅進行后續(xù)試驗。

2. 3 烏梅提取液質(zhì)量濃度及靜置時間對熒光假單胞菌殺滅效果的影響

由表3可知，隨質(zhì)量濃度的增加，烏梅提取液對熒光假單胞菌的殺滅效果不斷增強。14.00～18.00 mg/mL的烏梅提取液靜置32 h后對熒光假單胞菌仍有較強的藥效作用，尤其是18.00 mg/mL烏梅提取液的滅菌效果達100%，即無菌體存活；但6.00～10.00 mg/mL的烏梅提取液靜置8 h后且對熒光假單胞菌的殺滅效果明顯減弱，反而表現(xiàn)出快速增長的趨勢。

3 討論

我國中藥資源非常豐富，已有記載的約有12000種，且中藥具有純天然、無副作用、不易產(chǎn)生耐藥性等特點（肖輝等，2009），還能增強機體的免疫功能，減少病害發(fā)生（李霞等，2011；謝俊杰等，2016）。因此，中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用空間，研究中藥對水產(chǎn)常見致病菌的抑制作用對指導(dǎo)水產(chǎn)生產(chǎn)具有重要意義。關(guān)于烏梅提取液對水產(chǎn)常見致病菌的抑菌效果，王玉娥等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，烏梅提取液對副溶血弧菌的MIC和MBC均為12.50 mg/mL；彭金菊等（2009）研究報道，烏梅提取液對嗜水氣單胞菌的MIC和MBC分別為12.50和25.00 mg/mL；楊移斌等（2013a）研究報道，烏梅提取液對弗氏檸檬酸桿菌的抑菌直徑為21.00±0.21 mm；本研究結(jié)果表明，烏梅提取液對熒光假單胞菌的MIC和MBC分別為7.813和15.625 mg/L，抑菌直徑為18.46±0.27 mm。可見，烏梅提取液對熒光假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌等魚類致病菌均表現(xiàn)出較強抑菌作用，可能與烏梅提取液能促使菌體細胞破裂，抑制菌體蛋白正常代謝，最終導(dǎo)致菌體死亡有關(guān)（劉夢茵等，2011）。

本研究還發(fā)現(xiàn)，大黃提取液對熒光假單胞菌的抑菌直徑為17.23±0.18 mm，MIC為15.625 mg/mL；而何愛華等（2011）研究顯示，大黃對生物I-熒光假單胞菌的抑菌直徑為8.80±0.24 mm，MIC為11.00 mg/mL。二者間的差異可能與菌株來源、中藥提取工藝不同有關(guān)。本研究中，地榆、熟地黃、車前草等中藥提取液也表現(xiàn)出較好的抑菌效果，說明中藥具有廣譜殺菌作用，與其富含皂甙、黃酮類、有機酸等多種較強的抗菌成分有直接關(guān)系（趙明軍等，2009）。

從中藥提取液對熒光假單胞菌的MIC和MBC測定結(jié)果可以看出，以烏梅提取液對熒光假單胞菌的殺滅作用最明顯。本研究進一步通過測定不同質(zhì)量濃度（6.00、10.00、14.00和18.00 mg/mL）和靜置時間（2、8、16和32 h）對烏梅提取液殺滅熒光假單胞菌效果的影響，結(jié)果顯示，6.00～10.00 mg/mL的烏梅提取液在靜置2 h后能殺滅部分熒光假單胞菌，但靜置8 h后藥效降低，對熒光假單胞菌殺滅作用明顯減弱，菌體大量繁殖，且呈對數(shù)增長趨勢；14.00 mg/mL烏梅提取液在靜置16 h后能保持對熒光假單胞菌的較高殺滅效果，使菌體個數(shù)維持在較低水平；而18.00 mg/mL烏梅提取液在靜置32 h后，仍具有較強的藥效并將熒光假單胞菌完全殺滅?？梢?，較高質(zhì)量濃度的烏梅提取液對熒光假單胞菌的殺滅作用更有效，且藥效更持久。因此，在實際生產(chǎn)中使用烏梅提取液防治魚類赤皮病時，可適當(dāng)加大使用劑量，充分發(fā)揮其迅速有效的治療效果。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，烏梅提取液對熒光假單胞菌的抑菌效果最佳，在14.00～18.00 mg/mL的條件下能夠快速殺滅病原菌，在實際生產(chǎn)中可適當(dāng)加大使用劑量，充分發(fā)揮其迅速有效的治療效果。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）