楊璨　孫全　王微娜　耿帥鵬

摘要：【目的】克隆海島棉品種新海15中單萜合成酶基因（GbTPS），研究其受黃萎病誘導(dǎo)的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究該基因在棉花抗黃萎病中的功能打下基礎(chǔ)?！痉椒ā靠寺bTPS基因的開放閱讀框（ORF）全長序列，對(duì)其蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及病毒誘導(dǎo)的基因沉默對(duì)其抗病性進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】通過PCR擴(kuò)增得到一個(gè)全長為1761 bp的ORF序列，命名為GbTPS（GenBank登錄號(hào)：KP247548）。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼586個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為67.7 kD，等電點(diǎn)為5.79。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，GbTPS屬于Tps-g亞家族。GbTPS基因經(jīng)黃萎病菌誘導(dǎo)后，表達(dá)量在4～24 h內(nèi)顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于空白對(duì)照組。病毒誘導(dǎo)的基因沉默受黃萎病誘導(dǎo)后其病情指數(shù)為52.38，與對(duì)照組相比并無明顯差異?！窘Y(jié)論】GbTPS基因僅在棉花抗黃萎病的早期發(fā)揮積極作用。

關(guān)鍵詞： 棉花；單萜合酶；GbTPS基因；黃萎病；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)： S562；Q344 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）05-0604-07

Abstract：【Objective】A monoterpene synthetase gene GbTPS was cloned from Gossypiumbar badense， and its expression induced by Verticillium wilt were analysed， in order to lay a foundation for studying resistance of cotton to Verticillium wilt. 【Method】The full-length open reading frame（ORF） of GbTPS gene was cloned， and its encoded protein was analysed by bioinformatics， the real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） and virus induced gene silencing was used to analyse resistance to Verticillium wilt. 【Result】Full-length ORF was obtained， with length of 1761 bp， and named GbTPS（Genebank accession number： KP247548）. The bioinformatics analysis showed that， the protein composed of 586 amino acids was coded by GbTPS gene， its predicted molecular weight was 67.7 kD， its isoelectric point was 5.79. Phylogenetic tree analysis showed that， GbTPS belonged to Tps-g subfamily. The expression of GbTPS gene was significant（P<0.05） or extermely significant（P<0.01） higher than that of blank control within 4-24 h after being induced by Verticillium dahlia. The disease index of virus induced gene silencing was 52.38， and had no significant difference with that of control. 【Conclusion】Only at the early stage， the GbTPS gene plays a positive role in resistance to cotton Verticillium wilt.

Key words： cotton； monoterpene synthase； GbTPS gene； Verticillium wilt； qRT-PCR

0 引言

【研究意義】棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國乃至世界的經(jīng)濟(jì)發(fā)展中有著重要地位，是棉制品和服裝的重要材料來源，但生產(chǎn)中易受黃萎病菌的侵害而導(dǎo)致大量減產(chǎn)。萜類化合物是植物中種類最多的一類天然烴類化合物，又名類異戊二烯。目前，已分離到的萜類達(dá)4萬多種（胡永健等，2007）。植物中的萜類化合物包括初生代謝物和次生代謝物，其中次生代謝萜類化合物具有抗病蟲害的重要作用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，萜類合成的關(guān)鍵酶及其在防御作用中的分子機(jī)理逐漸成為植物防御研究中的熱點(diǎn)之一。萜類合成酶（Terpene Synthases，TPS）是萜類合成過程中的關(guān)鍵酶，也是棉花抗黃萎病過程中的一種重要酶，如δ杜松烯合成酶是合成棉花抗毒素的關(guān)鍵酶（Tan et al.，2000）?？共』蛟诳共∵^程中起著識(shí)別病原菌和開啟抗病信號(hào)途徑的重要作用，而萜類合成酶受萜類合成酶基因的調(diào)控。因此，研究萜類合成酶的相關(guān)基因是研究萜類化合物抗病性的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Mace等（1985）在研究萜類物質(zhì)的過程中發(fā)現(xiàn)，脫氧半棉酚對(duì)黃萎病菌的抗性優(yōu)于脫氧半棉酚甲醚、半棉酚和半棉酚甲醚。Mace等（1989）對(duì)感染黃萎病的海島棉進(jìn)行基因表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與萜烯生物合成途徑相關(guān)的基因均受黃萎病誘導(dǎo)表達(dá)。Kawchuk等（2001）從番茄中克隆到Ve1、Ve2兩個(gè)抗黃萎病基因。Zuo等（2005，2007）在接種黃萎病V991的海島棉7124中克隆獲得2個(gè)與乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的基因（GbERF1和GbERF2），后續(xù)研究證明它們可能在海島棉抗黃萎病的過程中發(fā)揮一定作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，前人已進(jìn)行了棉花黃萎病菌致病力分化（林玲等，2005；喬艷艷等，2015）、黃萎病QTL定位（劉劍光等，2014）等研究，而關(guān)于抗黃萎病基因的研究非常少。本課題組前期通過接種黃萎病菌的方法，對(duì)棉花不同時(shí)期及抗性品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，篩選到1個(gè)在接種后具有顯著差異表達(dá)的TPS基因片段，但該基因在棉花抗黃萎病中是否起關(guān)鍵作用仍需深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過克隆GbTPS基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)GbTPS基因在浸染黃萎病后進(jìn)行表達(dá)水平分析，研究GbTPS基因在抗病性中的作用，為闡釋其分子功能提供參考，并對(duì)GbTPS進(jìn)行病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS），以期為進(jìn)一步研究該基因的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試高抗黃萎病海島棉（Gossypium barbadense）品種新海15由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院安陽棉花研究所提供；黃萎病菌菌種（Verticillium dahlia）由河南省植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 總RNA抽提 播種前剪掉種殼頂端，將種子于清水中浸泡5～6 h后，放置于鋪有濕潤棉花的培養(yǎng)皿中，覆蓋一層濕潤的棉花，放置于培養(yǎng)箱中等待萌發(fā)。次日將已出芽的棉花種子播種于邊長為7 cm的花盆（土∶蛭石∶營養(yǎng)土=2∶1∶1）中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25 ℃，L∶D=16 h∶8 h）。

待幼苗長至2片真葉時(shí)，通過傷根處理，接種濃度為1×107 N/L的黃萎病菌，并于接種后24 h取葉片，通過無菌水清洗后，參考EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊公司）進(jìn)行RNA抽提，并將檢測合格的樣品置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 GbTPS基因克隆 利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得單鏈cDNA，體系為：RNA 3.0 μL，Oligo（dT）2.0 μL，DEPC水8.0 μL，70 ℃ 10 min；RNase 0.5 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，5×Buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，DEPC水3.5 μL，42 ℃ 90 min，72 ℃ 10 min。設(shè)計(jì)引物GbTPS-F和GbTPS-R對(duì)該基因進(jìn)行擴(kuò)增（表1），引物設(shè)計(jì)原則為上、下游引物分別位于該基因開放閱讀框的兩端，且盡量保證兩條引物的長度、退火溫度相差不明顯，盡量避免引物二聚體結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，引物由華大基因合成。

GbTPS基因的PCR反應(yīng)體系50.0 μL，包括5×Trans Start Fast Pfu Fly Buffer 10.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 5.0 μL、上游引物（GbTPS-F）和下游引物（GbTPS-R）各1.0 μL、DNA聚合酶（Trans Start Fast Pfu Fly DNA polymerase）1.0 μL、cDNA模板1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物膠回收后連接至pMD18-T載體并送華大基因測序。

1. 2. 3 基因生物信息學(xué)分析 編碼氨基酸序列的預(yù)測、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、等電點(diǎn)和分子質(zhì)量等分別通過Translate tool（http：//web.expasy.org/translate/）、ChloroP

1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）、Gneneva大學(xué)的ExPASy服務(wù)器（http：//μs.expasy.org/

tools/protparam.html）進(jìn)行分析。使用ClustalX 2.0進(jìn)行多重序列比對(duì)，運(yùn)用MEGA 3.1基于Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 4 qRT-PCR分析 待棉花苗長到2葉1心時(shí)，參考蘸根法進(jìn)行黃萎病的浸染，分別將浸染過和未浸染過的棉花苗在以下時(shí)間點(diǎn)取樣：0、1、4、8、12、24、36、48和72 h。參考1.2.1和1.2.2的方法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

使用引物qGbTPS-F和qGbTPS-R進(jìn)行PCR檢測，以UBQ7為內(nèi)參，引物序列見表1。反應(yīng)體系10.0 μL：含SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）5.0 μL，上、下游引物各0.3 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH2O 1.2 μL。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，使用ABI 7300熒光定量PCR儀的默認(rèn)程序進(jìn)行檢測，結(jié)果使用公式2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算。

1. 2. 5 VIGS載體pTRV-GbTPS構(gòu)建 使用引物GbTPS-

F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）擴(kuò)增GbTPS基因的部分片段用于構(gòu)建VIGS載體。

PCR反應(yīng)體系：Ex Taq Version 2.0 Plus dye（Premix Taq）10.0 μL，引物GbTPS-F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，加8.0 μL ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

上述擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物和pTRV（由棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）分別使用BamHⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序驗(yàn)證獲得陽性載體命名為pTRV-GbTPS，將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（GV3101）備用。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌方法：取100 μL農(nóng)桿菌感受態(tài)于冰上靜置，待其溶化，加入1 μL pTRV-GbTPS質(zhì)粒輕輕混合均勻，冰浴30 min后于液氮中速凍70 s，再迅速放入37 ℃水浴中保持5～6 min，于超凈工作臺(tái)中加入1 mL新鮮空白LB液體培養(yǎng)基，28 ℃下180 r/min搖床培養(yǎng)4 h，4000 r/min離心5 min，吸去500 μL LB液體培養(yǎng)基，懸浮菌體，涂布于含有相應(yīng)抗生素（卡那+慶大霉素/利福平）的培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。

1. 2. 6 GbTPS基因沉默 取pTRV-GbTPS和pTRV1、pTRV2（空載體）、Cla農(nóng)桿菌于含慶大霉素、卡那霉素、MES（10 mmol/L）和AS（15 μmol/L）的液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，收集菌體并浮于等體積浸染液，浸染液成分及其終濃度為：MES（10 mmol/L）、AS（150 μmol/L）、MgCl2（10 mmol/L）。將pTRV1與pTRV-GbTPS、pTRV2（空載體）及Cla農(nóng)桿菌懸浮液以1∶1的比例混合。

待培養(yǎng)的幼苗長到1葉（真葉）1心階段，選擇長勢(shì)良好的棉花苗進(jìn)行注射，于25 ℃培養(yǎng)箱中遮光處理24 h后正常培養(yǎng)。

1. 2. 7 黃萎病菌浸染 VIGS處理的棉花幼苗生長到2葉1心時(shí)，參考蘸根法將幼苗從培養(yǎng)盆里取出（Cla農(nóng)桿菌處理的幼苗除外），傷根后浸入黃萎病菌液中40 s并重新移栽到培養(yǎng)盆中，澆水并放回光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參考早（苗）期鑒定黃萎病發(fā)病程度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，適時(shí)觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。

1. 2. 8 GbTPS基因半定量RT-PCR分析 如上VIGS處理的棉花幼苗生長到2葉1心時(shí)，處理組（pTRV- GbTPS）和對(duì)照組（pTRV2）分別取3～4片第2真葉提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行半定量PCR。使用引物GbTPS-F（VIGS）和GbTPS-R（VIGS），其反應(yīng)體系為：Ex Taq Version 2.0 Plus dye（Premix Taq）10.0 μL，引物GbTPS-F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2. 1 GbTPS基因克隆

通過PCR擴(kuò)增得到約1700 bp的條帶（圖1），測序后該基因全長為1761 bp，與預(yù)期的棉花萜類合成酶基因一致，命名為GbTPS（GenBank登錄號(hào)：KP247548）。

2. 2 GbTPS蛋白質(zhì)序列的生物信息學(xué)分析

2. 2. 1 預(yù)測氨基酸序列的理化性質(zhì)分析 通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GbTPS基因編碼586個(gè)氨基酸序列；其分子質(zhì)量為67.7 kD，等電點(diǎn)為5.79，氨基酸N'端轉(zhuǎn)運(yùn)肽分析結(jié)果如表2所示：GbTPS含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，主要定位于葉綠體。

2. 2. 2 GbTPS蛋白的多序列列隊(duì)分析 多序列比對(duì)結(jié)果（圖2）顯示，GbTPS蛋白與其他蛋白序列一樣，也具有“DDxxD”、（N，D）D（L，I，V）x（S，T）xxxE和LQLYEASFLL保守序列，但缺少“RRx8R”基序，具有TPS家族典型的保守序列特征。其氨基酸N'端均有一段葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，這些特征均是植物單萜合酶的典型特征。因此，推測GbTPS可能是海島棉中的單萜合酶。

2. 2. 3 GbTPS蛋白的進(jìn)化分析 GbTPS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖3）表明，萜類合酶共有7個(gè)亞家族分支，分別為Tps-a、Tps-b、Tps-c、Tps-d、Tps-e、Tps-f和Tps-g，克隆得到萜類合酶GbTPS與擬南芥芳樟醇合成酶聚類到一個(gè)分支上，同屬于萜類合酶Tps-g亞家族，進(jìn)一步證明該基因是海島棉中一個(gè)單萜合酶基因，合成的單萜為非環(huán)狀單萜，易揮發(fā)。

2. 3 GbTPS基因的qRT-PCR表達(dá)模式分析

qRT-PCR檢測GbTPS在被黃萎病浸染后不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量，為消除黃萎病浸染時(shí)傷根處理對(duì)棉花根部造成的影響，以進(jìn)行同樣傷根處理但并未浸染黃萎病的健康苗作為對(duì)照。

空白對(duì)照組與試驗(yàn)組均以UBQ7基因作為內(nèi)標(biāo)，且分別以各自0 h時(shí)期的表達(dá)量作為參照因子，圖4為各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與試驗(yàn)組中GbTPS基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示：GbTPS基因的表達(dá)量在接種后呈升高—降低—升高—降低的波動(dòng)趨勢(shì)，在4～24 h內(nèi)其表達(dá)水平顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于對(duì)照組，之后其表達(dá)量便低于對(duì)照組，且在72 h時(shí)與對(duì)照組表達(dá)水平幾乎一致。

2. 4 GbTPS基因的VIGS誘導(dǎo)結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)組（pTRV-GbTPS）和對(duì)照組（pTRV2）所取的真葉樣品分別提取RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果如圖5所示。由圖5可看出，對(duì)照組能檢測到目的基因，而試驗(yàn)組中目的基因的表達(dá)量幾乎檢測不到，表明GbTPS基因已被沉默。

在VIGS處理幼苗經(jīng)黃萎病菌侵染后，統(tǒng)計(jì)其黃萎病的發(fā)病情況，結(jié)果如圖6所示。被干涉掉Cla基因的棉花苗出現(xiàn)白化癥狀（圖6-A），進(jìn)一步證明其干涉效果良好。從圖6-B可看出，試驗(yàn)組和對(duì)照組均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，由試驗(yàn)組和對(duì)照組整體發(fā)病情況的對(duì)比（圖6-C）可以看出，其結(jié)果并無明顯差異。根據(jù)病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）顯示，試驗(yàn)組的病情指數(shù)與空白對(duì)照組無明顯差別，說明該基因的沉默并未對(duì)棉花的發(fā)病情況造成影響。

3 討論

單萜化合物在棉花抗黃萎病過程中發(fā)揮重要作用。單萜為C10類萜類化合物，含有保守性結(jié)構(gòu)域“DDXD”，該結(jié)構(gòu)域位于活性位點(diǎn)的入口處，具有結(jié)合二價(jià)金屬陽離子（如Mg2+）的功能（Sacchettni and Poulter，1997）；此外，植物的單萜合酶還具有“RRx8R”保守域和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（Aubourg et al.，2002）。萜類合酶均起源于古萜類合酶，根據(jù)其同一亞家族的不同氨基酸序列間至少有40%一致性的標(biāo)準(zhǔn)，將其分為7個(gè)亞家族（Tps-a～Tps-g）（Bohlmann et al.，1998），其中Tps-b、Tps-d、Tps-f和Tps-g 4個(gè)亞家族包含單萜合酶，Tps-a亞家族包含倍半萜合酶和二萜合酶（Chen et al.，2011）。通過生物信息學(xué)分析，本研究克隆得到的GbTPS基因編碼氨基酸序列具有“DDxxD”和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽等單萜所特有的保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)也含有LQLYEASFLL、DDxxD和xxSxxxE等萜類共有的保守結(jié)構(gòu)域，表明該基因?yàn)榈湫偷膯屋坪厦富?。通過ClustalX 2.0進(jìn)行序列對(duì)比，MEGA 3.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，其結(jié)果表明該基因與擬南芥芳樟醇合成酶同屬于Tps-g亞家族。

本研究的qRT-PCR結(jié)果表明，GbTPS基因的表達(dá)量呈升高—降低—升高—降低的波動(dòng)趨勢(shì)，與前人報(bào)道萜類釋放具有節(jié)律性的結(jié)果一致（Rohdichet al.，2005；Withers and Keasling，2007），且該節(jié)律性受對(duì)應(yīng)的萜類合成酶的調(diào)控。棉花在浸染黃萎病后1 h內(nèi)表達(dá)量低于對(duì)照組，在4～24 h內(nèi)表達(dá)量顯著或極顯著高于對(duì)照組，之后又低于對(duì)照組，且在72 h時(shí)其表達(dá)量幾乎與對(duì)照組無差別，表明4～24 h內(nèi)該基因受黃萎病誘導(dǎo)顯著上調(diào)，且在感染黃萎病的1 h內(nèi)及24 h后其表達(dá)受到抑制，故推測該基因在棉花感染黃萎病菌后的4～24 h內(nèi)可能具有抗病作用。VIGS處理結(jié)果表明，缺失GbTPS基因的棉花在浸染黃萎病后其發(fā)病情況與對(duì)照組相比并無明顯差異，結(jié)合qRT-PCR結(jié)果，表明GbTPS基因可能只在棉花感染黃萎病菌的初期具有抗病作用。本研究對(duì)GbTPS基因的抗黃萎病性進(jìn)行了初步探索，后續(xù)研究將定位于棉花感染黃萎病的初期階段。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，海島棉單萜合成酶基因GbTPS僅在棉花抗黃萎病的早期發(fā)揮積極作用。

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（責(zé)任編輯 王 暉）