杜傳來　羅海波　彭昕　王韋華　郁志芳

摘要：【目的】建立適合于茭白線粒體蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)體系，為進(jìn)一步開展茭白線粒體差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考?！痉椒ā恳攒诪樵囼?yàn)材料，比較不同線粒體提取純化方法、IPG膠條pH范圍及蛋白上樣量等條件對(duì)雙向電泳圖譜的影響。【結(jié)果】差速離心（3000～14000×g）聯(lián)合Percoll不連續(xù)密度梯度離心（20%∶24%∶40%=2∶4∶2）對(duì)茭白線粒體的提取純化效果優(yōu)于僅采用差速離心。采用改良酚抽法提取茭白線粒體蛋白，17 cm、pH 3～10的IPG膠條，1.0 mg上樣量，12% SDS-PAGE進(jìn)行雙向電泳，0.12%考馬斯亮藍(lán)G-250膠體考染法染色，茭白線粒體蛋白主要分布在pH 4～8范圍內(nèi)，pH 3～4和pH 8～10范圍內(nèi)蛋白點(diǎn)較少；進(jìn)一步選用pH 4～7和pH 5～8的IPG膠條對(duì)茭白線粒體蛋白進(jìn)行雙向電泳，分離效果均明顯提高，且pH 4～7范圍內(nèi)IPG膠條的雙向電泳圖譜清晰，蛋白點(diǎn)分辨率較高。分別采用0.8、1.0和1.2 mg 3個(gè)不同的上樣量進(jìn)行雙向電泳，結(jié)果表明上樣量為1.0 mg時(shí)，電泳圖譜質(zhì)量最好。【結(jié)論】通過差速離心聯(lián)合Percoll不連續(xù)密度梯度離心提取純化茭白線粒體，并控制好雙向電泳體系的pH范圍、上樣量等因素，可獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰、分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜。

關(guān)鍵詞： 茭白；線粒體；雙向電泳；蛋白質(zhì)組學(xué)

中圖分類號(hào)： Q81 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）03-0332-05

0 引言

【研究意義】線粒體是存在于絕大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)的一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸氧化、電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的場(chǎng)所，也是產(chǎn)生能量的場(chǎng)所；在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞程序性死亡過程中，線粒體也發(fā)揮著重要作用。這些復(fù)雜生理功能的實(shí)現(xiàn)與線粒體內(nèi)含有的多種蛋白質(zhì)密切相關(guān)（田世平等，2011；黃鳳蘭等，2012）。因此，進(jìn)行線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究有助于更好地闡明線粒體的生理功能及其在生命活動(dòng)中的作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已有相關(guān)報(bào)道。Millar等（2001）對(duì)擬南芥培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體蛋白進(jìn)行雙向電泳分析，從雙向電泳圖譜上可分辨出大約100個(gè)高豐度線粒體蛋白和250個(gè)低豐度線粒體蛋白。Millar等（2004）研究了水稻幼苗在6 d缺氧后1 d有氧適應(yīng)期和7 d有氧條件下線粒體蛋白的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)缺氧條件下呼吸氧化相關(guān)酶活性顯著升高，同時(shí)細(xì)胞色素C氧化酶豐度顯著低于對(duì)照。Qin等（2009a，2009b）研究了蘋果和桃果實(shí)衰老過程中的線粒體蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)、電子傳遞鏈、碳水化合物代謝及抗脅迫相關(guān)蛋白存在表達(dá)差異，尤其在高氧脅迫下錳超氧化物歧化酶表達(dá)量顯著上調(diào)。此外，應(yīng)用線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理方面也有研究報(bào)道（郭寶健等，2007；陳鵬等，2011）。關(guān)于茭白蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，目前主要集中在總蛋白質(zhì)組差異表達(dá)方面。Luo等（2012）研究了鮮切茭白冷藏期間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，結(jié)果表明，切分誘導(dǎo)了茭白自身抗氧化和抗病原菌系統(tǒng)，但也不可避免地加速了茭白細(xì)胞結(jié)構(gòu)的解體和衰老。羅海波等（2014）研究了茭白冷藏期間蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)物質(zhì)代謝過程的調(diào)整、能量代謝途徑的改變、活性氧清除能力的減弱及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的解體可能是導(dǎo)致茭白采后衰老的重要原因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，從植物中提取線粒體相對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言需增加移除細(xì)胞壁的離心程序，限制了植物材料線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究。目前已有研究針對(duì)擬南芥和水稻等模式作物生長(zhǎng)發(fā)育或脅迫條件下線粒體蛋白質(zhì)組的變化，但在其他植物材料中有關(guān)線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究較少，關(guān)于茭白線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以茭白為研究對(duì)象，擬通過對(duì)茭白線粒體提取純化方法及雙向電泳條件的優(yōu)化，建立適合于茭白線粒體蛋白質(zhì)分離的雙向電泳技術(shù)體系，為進(jìn)一步開展茭白線粒體差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用茭白購(gòu)自南京市衛(wèi)崗菜市場(chǎng)，選擇大小一致、無病蟲害及機(jī)械損傷的茭白，自來水沖洗后剝?nèi)ネ鈿と~鞘，迅速用液氮冷凍，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器設(shè)備：Beckman高速冷凍離心機(jī)（AJ-30i Beckman公司）、Beckman超速冷凍離心機(jī)（OptimaL- 100XP Beckman公司）、等電聚焦電泳系統(tǒng)（ProteinI12IEF 美國(guó)伯樂公司）、高重復(fù)性高通量大型垂直電泳儀（EttanDALTTwelve GE-061-TY7119 GEHealthcare）和ImageScanner Ⅲ掃描儀（28-9076-07 GEHealthcare）。

主要試劑：牛血清蛋白（BSA）、Percoll、Tris平衡酚、兩性電解質(zhì)（Bio-Lyte）、丙烯酰胺（Arc）、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、考馬斯亮藍(lán)G-250等，均為AR級(jí)。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 線粒體提取 參照祝美云等（2012）的方法。稱取茭白400 g，加入4 ℃預(yù)冷的提取液[內(nèi)含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1%（w/v）BSA、0.5%（w/v）PVP-30、0.1%（w/v）半胱氨酸]800 mL，在組織勻漿機(jī)中勻漿3次，每次15 s，然后用4層紗布過濾，濾液在4 ℃下3000×g離心20 min，取上清液在4 ℃下14000×g離心20 min，將沉淀用80 mL洗滌液[內(nèi)含10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1% BSA]洗滌，4 ℃下14000×g離心20 min，重復(fù)洗滌步驟，得到的沉淀即為粗線粒體。

1. 2. 2 線粒體純化 參照Qin等（2009b）的方法。將粗線粒體用12 mL懸浮液（內(nèi)含10 mmol/L Tris-HCl、0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA）懸浮，然后將粗線粒體懸浮液小心鋪在20%∶24%∶40%（2∶4∶2）Percoll（10 mmol/L Tris-HCl、0.3 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA）不連續(xù)密度梯度上，4 ℃下45000×g離心45 min，取24%/40%層不透明淺黃色線粒體環(huán)，用50 mL懸浮液洗滌，4 ℃下14000×g離心20 min，重復(fù)洗滌步驟，沉淀即為高純度線粒體。

1. 2. 3 線粒體蛋白提取與含量測(cè)定 線粒體蛋白提取純化參照Luo等（2012）的改良酚抽法進(jìn)行。在純化前或純化后的線粒體沉淀中加入10 mL裂解液[內(nèi)含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、2%（v/v）β-巰基乙醇、1 mmol/L PMSF]，冰浴中進(jìn)行超聲波降解30 min，得到線粒體蛋白液。蛋白質(zhì)含量參照Bradford（1976）的方法進(jìn)行測(cè)定。

1. 2. 4 雙向電泳 參照Luo等（2012）的方法。第一向等點(diǎn)聚焦采用17 cm的Bio-Rad公司IPG膠條，等點(diǎn)聚焦pH選取pH 3～10、pH 4～7、pH 5～8等3個(gè)梯度，上樣體積均為350 μL，上樣量分別設(shè)置0.8、1.0和1.2 mg。等點(diǎn)聚焦程序：50 V 12.0 h、100 V 1.0 h、200 V 1.0 h、500 V 1.0 h、1000 V 1.0 h、4000 V 2.0 h、8000 V 9.5 h，儀器運(yùn)行條件為20 ℃，每根膠條極限電流30 μA。聚焦結(jié)束后，轉(zhuǎn)入第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度12%，恒定功率每根膠條1 W運(yùn)行1.5 h，然后每根膠條15 W運(yùn)行4.0 h，直到溴酚藍(lán)前沿到達(dá)凝膠底部終止電泳，用0.12%考馬斯亮藍(lán)G-250膠體考染法染色。

1. 2. 5 凝膠圖像采集與分析 凝膠圖像用ImageScanner Ⅲ掃描儀進(jìn)行采集，保存為GSC的圖像文件，用PDQuest 8.0.1軟件進(jìn)行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2. 1 線粒體的提取純化

分別取純化前的粗線粒體沉淀和純化后的線粒體沉淀，用改良酚抽法提取線粒體蛋白進(jìn)行雙向電泳分析，比較兩種線粒體提取純化方法對(duì)雙向電泳效果的影響。如圖1所示，僅采用差速離心獲得的粗線粒體蛋白經(jīng)雙向電泳后雙向電泳圖譜（圖1-A）清晰，蛋白點(diǎn)較多；而采用差速離心聯(lián)合Percoll不連續(xù)密度梯度離心獲得的線粒體蛋白經(jīng)雙向電泳后雙向電泳圖譜（圖1-B）分辨率較高，純化前雙向電泳圖譜上出現(xiàn)的部分蛋白質(zhì)點(diǎn)在純化后未出現(xiàn)，同時(shí)純化前未出現(xiàn)的蛋白質(zhì)點(diǎn)在純化后的雙向電泳圖譜上清晰顯現(xiàn)，表明經(jīng)Percoll不連續(xù)密度梯度離心后線粒體純度明顯提高，同時(shí)部分線粒體蛋白質(zhì)得到有效濃縮。

2. 2 IPG膠條pH范圍對(duì)雙向電泳效果的影響

為獲得適合于茭白線粒體蛋白分離的IPG膠條pH范圍，用改良酚抽法提取茭白粗線粒體蛋白，采用17 cm、pH 3～10的IPG膠條、1.0 mg上樣量、12% SDS-PAGE進(jìn)行雙向電泳，0.12%考馬斯亮藍(lán)G-250膠體考染法染色。圖2-A顯示，茭白線粒體蛋白主要分布在pH 4～8范圍內(nèi)，pH 3～4和pH 8～10范圍內(nèi)蛋白點(diǎn)較少，但pH 4～8范圍內(nèi)的蛋白點(diǎn)過于集中且出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，表明pH 4～8可能是茭白線粒體蛋白分離的適宜pH。進(jìn)一步選用pH 4～7和pH 5～8的IPG膠條對(duì)茭白線粒體蛋白進(jìn)行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)分離效果均明顯提高，pH 3～10范圍內(nèi)未分開的點(diǎn)在pH 4～7范圍（圖2-B）和pH 5～8（圖2-C）范圍內(nèi)均能有效分開，且點(diǎn)跡清晰，僅少數(shù)高豐度大分子量蛋白點(diǎn)有重疊。圖2-B和圖2-C還顯示，pH 4～7范圍內(nèi)IPG膠條的雙向電泳圖譜清晰，蛋白點(diǎn)分辨率較高，但pH 7～8范圍內(nèi)存在蛋白點(diǎn)丟失現(xiàn)象；pH 5～8范圍內(nèi)IPG膠條的雙向電泳圖譜清晰，pH 7～8范圍內(nèi)蛋白點(diǎn)完全分開，但pH 4～5范圍內(nèi)蛋白點(diǎn)丟失，且部分蛋白點(diǎn)仍存在重疊現(xiàn)象，未能有效分開。

2. 3 不同上樣量對(duì)雙向電泳效果的影響

17 cm的IPG膠條采用考馬斯亮藍(lán)染色法顯色，其適宜的上樣量在1.0 mg左右（趙玲玲等，2015）。因此，本研究在其他條件相同的情況下，分別取改良酚抽法獲得的茭白粗線粒體蛋白樣品0.8、1.0和1.2 mg進(jìn)行分析。上樣量為0.8 mg時(shí)，雖然雙向電泳圖譜背景清晰、蛋白質(zhì)點(diǎn)較多且無拖尾現(xiàn)象，但低豐度蛋白點(diǎn)很少，部分低豐度蛋白未能在圖譜上顯現(xiàn)，在一定程度上影響了雙向電泳的準(zhǔn)確性和重復(fù)性（圖3-A）；上樣量為1.0 mg時(shí)，蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)較多、清晰且分布均勻，低豐度蛋白得到很好呈現(xiàn)，僅少量高豐度大分子量蛋白質(zhì)存在重疊現(xiàn)象，圖譜質(zhì)量較好（圖3-B）；上樣量提高至1.2 mg時(shí)，低豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)明顯增多，但高豐度蛋白質(zhì)斑點(diǎn)過大，未能有效分開，造成交叉重疊，影響其他蛋白點(diǎn)的分離與分析，甚至出現(xiàn)橫向拖尾現(xiàn)象（圖3-C）。

3 討論

3. 1 線粒體提取純化方法

線粒體的純度是影響線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要因素。目前，線粒體分離純化主要采用差速離心聯(lián)合密度梯度離心的方法。有研究表明，可使線粒體有效分離的離心力為3000～13000×g，經(jīng)過多次差速離心也可純化線粒體，但離心工作量很大且獲得的線粒體純度不高（賀芳和何大澄，2005）。密度梯度離心可將差速離心獲得的粗線粒體進(jìn)一步純化，有效去除其他細(xì)胞器蛋白質(zhì)的污染，提高純化效率。密度梯度離心常用的介質(zhì)主要有氯化銫、蔗糖、Ficoll、Percoll及Nycodenz等，其中蔗糖和Percoll在植物細(xì)胞線粒體的分離中較常用（施蘇雪等，2012）。Qin等（2009b）采用1200～17000×g差速離心聯(lián)合8%∶12%∶30%=2∶4∶1 Percoll不連續(xù)密度梯度離心和21% Percoll自形成密度梯度離心提取純化蘋果線粒體，獲得可用于蛋白質(zhì)組分析的高純度線粒體。本研究選用3000～13000×g差速離心聯(lián)合Percoll不連續(xù)密度梯度離心（20%∶24%∶40%=2∶4∶2）后可獲得較理想的純化效果。

3. 2 IPG膠條pH范圍

IPG膠條pH范圍選擇是影響雙向電泳圖譜蛋白質(zhì)分辨率和靈敏度的重要因素。合適的IPG膠條pH范圍可獲得背景清晰、分辨率和靈敏度均較高的雙向電泳圖譜，反之則可能使分子量和等電點(diǎn)相近的蛋白質(zhì)難以有效分離，或丟失其pH范圍之外的有用蛋白。陳征等（2013）研究比較了不同膠條長(zhǎng)度及pH范圍對(duì)小麥小花線粒體蛋白雙向電泳圖譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)點(diǎn)主要集中在pH 4～7范圍內(nèi)，采用17 cm、pH 4～7的IPG膠條能夠更好地聚焦分離小麥小花線粒體蛋白質(zhì)組。李建友（2007）對(duì)鹽脅迫誘導(dǎo)水稻根尖細(xì)胞程序性死亡早期線粒體蛋白質(zhì)組變化的研究表明，pH 4～7是分離水稻根尖細(xì)胞線粒體蛋白的適宜范圍。而Qin等（2009a）研究發(fā)現(xiàn)，桃果實(shí)線粒體蛋白質(zhì)采用pH 3～10范圍內(nèi)的IPG膠條進(jìn)行雙向電泳可獲得質(zhì)量較好的雙向電泳圖譜。本研究首先采用pH 3～l0的IPG膠條對(duì)茭白線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)茭白線粒體蛋白質(zhì)主要分布在pH 4～8范圍內(nèi)，因而改用pH 4～7和pH 5～8的IPG膠條進(jìn)一步雙向電泳分離，最終確定采用pH 4～7適宜于茭白線粒體蛋白質(zhì)的分離，分離效率和分辨率均顯著提高。

3. 3 上樣量的選擇

蛋白質(zhì)上樣量是影響雙向電泳圖譜清晰度及蛋白質(zhì)點(diǎn)多少的另一重要因素。上樣量過低導(dǎo)致蛋白質(zhì)點(diǎn)較少，低豐度蛋白顏色較淺且難以發(fā)現(xiàn)，造成部分蛋白信息丟失；上樣量過高會(huì)導(dǎo)致高豐度蛋白點(diǎn)過大而掩蓋相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)相近的其他重要低豐度蛋白（張僑等，2010）。研究表明，上樣量不僅與染色方法及IPG膠條長(zhǎng)度有關(guān)，還與IPG膠條pH范圍、高豐度和低豐度蛋白的分布等有關(guān)（羅海波等，2013）。因此，在染色方法、IPG膠條長(zhǎng)度、上樣方法等均一致的條件下，對(duì)上樣量進(jìn)行優(yōu)化是提高雙向電泳圖譜質(zhì)量的有效途徑。Qin等（2009a）對(duì)桃果實(shí)線粒體蛋白質(zhì)雙向電泳體系研究表明，采用13 cm、pH 3～10的IPG膠條，最適蛋白上樣為0.6 mg。本研究選用17 cm、pH 4～7的IPG膠條、考馬斯亮藍(lán)G-250染色，比較了0.8、1.0和1.2 mg不同上樣量的雙向電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)上樣量為1.0 mg時(shí)得到電泳圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量多，分辨率較高，重疊現(xiàn)象少。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，通過差速離心聯(lián)合Percoll不連續(xù)密度梯度離心提取純化茭白線粒體，并控制好雙向電泳體系的pH范圍、上樣量等因素，可獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰、分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜。

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（責(zé)任編輯 王 暉）